疫组化1-概论抗原抗体

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1、免疫组化Immunohistochemistry学习本章节的总体要求*1.熟悉免疫组织化学技术特点及其原理*2.掌握免疫组织化学染色的操作流程*3.熟悉免疫化学反应相关术语及其所用免疫试剂的来源和质量控制4.了解多克隆抗体制备程序与操作要求5.了解单克隆抗体制备原理和步骤概论一、什么是免疫组织化学免疫组织化学是应用免疫学和组织化学原理，对细胞组织标本中的某些多肽、蛋白质等大分子物质进行定性、定位、定量研究的一门科学。这项技术本质上是一种染色及原位示踪技术，它是在酶组织化学基础上发展起来的，始于20世纪中期。二、发展历史免疫荧光标记

2、抗体技术---Coons1940年免疫酶标抗体技术---Abakane1963不标记酶抗体（酶抗酶复合物）技术---Sternberger1970胶体金免疫标记技术和亲和标记技术---Hsu1985免疫试剂，自1975年Kohler和Milstein发明了单克隆抗体制备的杂交瘤技术后，已从采用多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代。目前商品供应的特异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多数都为单克隆抗体。1.特异性强专一2.敏感性高检测阈值达ng或pg水平3.定位准确既可定性、定位，又可定量4.三位一体形态、功能和代谢三结合缺点：干扰

3、多，易出现假阳性三、技术特点（优点）（一）组织处理与切片选择（二）免疫染色的前处理试剂准备（示踪，放大，标记）消化阻断*（三）免疫组化染色原理、优缺点、流程（四）免疫染色的后处理增强、衬染、封固四、免疫组织化学染色操作步骤*（五）结果判断与对照设置方法众多敏感不同程序雷同按需选用关键步骤：特异抗体-----桥联抗体----标记抗体种系必需匹配（第一抗体）（第二抗体）（第三抗体）第一节抗原和抗体一、抗原：凡能刺激机体产生特异性免疫应答（免疫原性），并能与相应免疫应答物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特异性结合（反应原性）的物质。

4、抗原的免疫原性取决于抗原的①异物性；②大分子；③表面积；④专一决定簇等。免疫原性反应原性完全抗原completeantigen有有半抗原hepten无有半抗原＋载体蛋白全抗原载体蛋白：BSA、多聚赖氨酸、牛甲状腺球蛋白等；（免疫原性强，易获得，交叉反应易去除）交联要求：不改变半抗原的分子构型；远离半抗原的抗原决定簇；高结合率（结合半抗原数目至少20个以上）交联剂抗原决定簇(表位)：抗原分子中决定抗原特异性的活性化学基团，其性质、数量、空间构型决定抗原的特异性。---免疫组化的精确性、特异性交叉反应：抗原（或抗体）除与其相应抗体（或

5、抗原）特异结合外，有时可与其他抗体（或抗原）发生反应。---多数天然抗原表面带有多个相同或不同的表位---不同抗原的表位相同或相似的情况下可发生交叉反应---免疫组化的假阳性二、抗体B细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，又称免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。---可与相应抗原特异性结合---亦可作为抗原，激发免疫应答抗体的分子结构1.抗体分子在立体构型上都是Ig，但Ig不都是抗体。2.各类Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构,包括二条相同的重链(heavychain,H链),及二条相同的轻链(light

6、chain,L链),每条重链(H链)和轻链(L链)分为氨基端(N端)和羧基端(C端)。3.两条重链间，两条轻链间及重链和轻链间，分别借二硫键连接。此为免疫球蛋白的基本结构，又称为免疫球蛋白的单体,呈“Y”字构型。4.重链上结合有不同量的糖,故Ig属糖蛋白。根据重链抗原性的不同可分为5类，即μ链，γ链，α链，δ链和ε链，由它们组成的Ig分别称为IgM，IgG，IgA，IgE和IgD。5.轻链也可根据其化学结构和抗原性的差异分为κ和λ二型。一个Ig分子的二条轻链型别相同，绝无可能κ型和λ型共同存在于同一个Ig分子中。6.Ig单体的氨基

7、酸序列可分为恒定区（constantregion,C区)和可变区（variableregion,V区）。---可变区位于Ig多肽链的N端，占轻链的约1/2及重链的约1/4（Ig结合抗原的所在部位）---恒定区位于Ig多肽链的C端，占轻链的余下的1/2及重链的3/4（补体结合域，Fc受体结合位点，Ig抗原决定簇等所在部位）7.Ig的水解片断可因选用的水解酶不同而异。采用木瓜蛋白酶(papain)水解Ig时：---2个相同的Fab(fragmentantigenbinding)段，即抗原结合片断---1个Fc（fragmentcr

8、ystalliable)段，即可结晶片断，拥有Ig抗原决定簇。采用胃蛋白酶（pepsin），其酶切位点在Ig重链间二硫键近羧基端---一个具双价抗体活性的F(ab’)2片断---一个不具任何免疫活性的Fc’片断。8.抗体的蛋白类型主要为IgG和Ig