生物课件植物DNA、RNA及蛋白的提取与分析

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1、植物DNA、RNA及蛋白的提取与分析植物DNA提取DNA提取原则保证DNA结构的完整性排除有机溶剂和金属离子的污染排除其它核酸分子的污染蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度纯化后不应存在对酶抑制性的物质植物DNA提取的方法CTAB法SDS法煮提法--植物DNA提取的经典方法DNA提取的基本步骤材料的准备（新鲜或冷冻保存）细胞的裂解（液氮研磨，释放内容物）DNA的分离与纯化（酚氯仿抽提）DNA的沉淀与洗涤（2V无水乙醇或2/3V异丙醇）DNA的干燥与溶解（ddH2O或TE）CTAB法流程离心洗涤植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解沉淀CTAB提取液主要成分C

2、TAB：十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。Tris-HCl(pH8.0):提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。EDTA:螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性。NaCl:提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。1.取约0.1g的水稻叶片在液态中磨成粉末，将适量的粉末材料转移至1.5mlEP管中。2.加入600µl预热（95℃）的1.5×CTAB缓冲液，然后65℃温浴20~60min。3.取出EP管，冷却后加入600µl氯仿:异戊

3、醇（24:1）混合均匀，然后10000rpm离心10min，取出后吸取上清液到另一新的EP管中。4.加入2/3V异丙醇或2V无水乙醇混合均匀，冰浴至DNA丝状物出现。5.稍微离心沉淀DNA，倒掉上清液。6.加入600µl75%乙醇洗涤，放置30min。7.倒掉上清液，室温下吹干DNA。8.加入100µlTE溶解DNA。9.取5-10ul电泳检测提取效果10.-20℃下贮存备用CTAB法步骤注意事项1.所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。2.所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3.在提取过程，应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得

4、到较长的DNA。DNA的质量检测电泳带型单一无拖尾现象点样孔无残留杂质OD值测定DNA纯品的OD260/OD280为1.8，若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。植物RNA提取分离RNA的目的RT-PCRNorthernblot构建cDNA文库GeneChips体外翻译RNA提取的关键--防止RNase降解RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。研究人员的手、唾液、灰尘、器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、各种试剂及各种组织

5、和细胞中。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。1.耐高温的器具（如玻璃制品、研钵、剪刀、镊子等）于180℃下干烤8h2.塑料耗材（Tip、EP管等）用0.1%的DEPC水浸泡过夜，然后高压，再烤干备用3.实验用的氯仿、乙醇为RNA专用，水为DEPC处理水4.使用有效的RNase抑制剂：如异硫氢酸胍

6、、RNasin5.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制6.实验过程需带一次性塑料手套且经常更换7.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。注意：DEPC有致癌之嫌，必须小心操作，防止接触与吸入！防止RNase污染的措施常用的RNase抑制剂DEPC(焦磷酸二乙酯):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。异硫氢酸胍∶目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使R

7、NA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。RNasin(RNA酶的蛋白质抑制剂）一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。1.胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和-巯基乙醇变性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀。2.氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损失，而且