中国药品检验标准操作规程2010版

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1、中国药品检验标准操作规程2010版微生物限度检查法微生物限度检查法一、细菌、霉菌和酵母菌计数１简述细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。也是用于评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者的卫生状况的重要手段和依据。细菌、霉菌和酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一。以在琼脂平板上的细菌、霉菌和酵母菌形成一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在该规定条件下所生长的细菌（为一群嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试品中所测得

2、的菌落数，实际为菌落形成单位数（colonyformingunity，cfu）。2设备、仪器微生物限度检查应有单独的洁净实验室，每个洁净实验室应有独立的净化空气系统。操作间与缓冲间之间应有样品传递舱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。洁净实验室内的温度应控制在18～26℃，相对湿度最好在40％～60％。操作间安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于10Pa，操作间与缓冲间也应保持相对正压，不低于5Pa。操作间和净化工作台采用沉降菌数测定（Ⅱ法）检测其洁净度，分别应达到10000级和100级。在每次操

3、作前、后用0.1％苯扎溴铵溶液擦拭操作台，然后启动层流净化装置。吸管、培养皿洗净后用牛皮纸包扎，高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干备用。3培养基制备：采用干燥培养基，按说明配制，在2h内灭菌，避免细菌繁殖。灭菌后的培养基应保存在2～25℃，防止被污染，在3周内用毕。制备好的培养基放置时间不宜过长，以免水分散失及染菌。采用微波炉加热熔化琼脂培养基，已熔化的培养基应8h内一次用完，剩余培养基不宜再用。4供试品抽样、检验量采用随机抽样方法，其抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的3～5倍量（以备复试或留样观察）。所有剂型的检验量均需取自2个以上包装单位，固体制剂检验量为10g。检查沙门

4、菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）。第1页，共27页中国药品检验标准操作规程2010版微生物限度检查法5试验准备将供试品及所有已灭菌的平皿、试管、吸管（1ml、10m1）、稀释剂等移至洁净实验室内。开启洁净实验室空气过滤装置工作30min。紫外灭菌30min。6.3操作人员穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。先用乙醇棉球擦手，再擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。6供试液的制备和释稀（10倍递增稀释法）取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液至100ml水浴振荡混匀（温度45%），作为1：10供试液

5、。用1支1ml灭菌吸管吸1:10均匀供试液1ml，加入装有9mlpH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂的试管中，混匀，即得1:100供试液。以此类推，根据供34试品污染程度，可稀释至1:10、1:10等适宜稀释级。每递增l稀释级，必须另换一支吸管。稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次，完成后将吸管放入消毒液缸内。7计数方法验证由于某些供试品具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。9.1验证用菌株大肠埃希菌Escherichia

6、coli[CMCC(B)44102]，金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus[CCMCC(B)26003]，枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis[CMCC(B)63501]，白色念珠菌Candidaalbicans[CMCC(F)98001]，黑曲霉菌Aspergillusniger[CMCC(F)98003]。菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养24～48h。上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌

7、数为50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml／m1）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml／ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～l00cfu的孢子悬液。菌悬液制备后，若在室温下放置应在2h内使用，若保存在2～8℃的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲