生物化学第7章蛋白质的分离、纯化和表征

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1、第7章蛋白质的分离、纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质分子的大小与形状三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀四、蛋白质分离纯化的一般原则五、蛋白质的分离纯化方法六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定(Isolation,purificationandcharacteristicsofproteins)表征：事物显露在外的征象一、蛋白质的酸碱性质蛋白质的等电点和等离子点对某一种蛋白质来说，在某一pH下，它所带的正电荷总数与负电荷总数刚好相等，这个pH叫该蛋白质的等电点（Isoelectricpoint）。在没有其它盐类干扰时，蛋白质的质子供体基团解离出的质子数与

2、质子受体基团接受的质子数相等时的pH叫该蛋白质的等离子点（isoionicpoint）。等离子点是蛋白质的一个特征常数？二、蛋白质分子的大小与形状根据化学组成测定最低分子量用化学分析的方法测出蛋白质中某一物质（原子）或某一含量很低的氨基酸残基的含量，并假设蛋白质分子中只有一个该物质分子或原子，则可以计算出该蛋白质的最低分子量。例如，肌红蛋白含铁量为0.335%，其最低分子量可按下式算出：根据化学组成测定最低分子量若蛋白质中含有n个被测原子，则分子量等于最低分子量×n.若蛋白质中某种氨基酸的含量特别低，通过测定这种氨基酸的含量，也可用此法计算出蛋白质的分子

3、量。渗透压测定的示意图Van’tHoff公式在理想溶液中，溶液的渗透压与溶质浓度的关系可用Van’tHoff公式表示：式中π是渗透压（N/m2，即Pa），V是溶液的体积（m3），n是溶液中溶质的摩尔数，g是溶质的质量（g），c是溶质的浓度（g/m3），T是绝对温度（K），R是气体常数（8.314J/K·mol），Mr为溶质的分子量或摩尔质量（g/mol）。渗透压法测定蛋白质的分子量在一种理想溶液中，渗透压与溶质浓度成正比。但是实际上蛋白质溶液与理想溶液有较大的偏差。在溶质浓度不大时，它们的关系可用下式表示：当c趋向于0时，RTKc趋向于0，但π/c不趋向

4、于0，而是趋向于一定值。渗透压法测定蛋白质的分子量测定几个不同浓度下的渗透压，以π/c对c作图，并外推至c为0时的π/c，再代入上式求得Mr。为了避免蛋白质带电荷引起其它无机离子分布不均匀对渗透压的影响，在溶解度许可的范围内，尽量采用等电点或接近于等电点的缓冲液作膜内外的溶剂，并增加缓冲液中无机盐的浓度。沉降分析法测定蛋白质的分子量用沉降分析法测定蛋白质分子的相对分子量需要超速离心机，超速离心机的转速可以达到每分钟6万～8万转，这样高的转速使得被离心的分子受到的离心力达到40万～70万g。超速离心机工作原理制备型超速离心机分析型超速离心机被离心分子的受力

5、分析沉降速度法Ⅰ在离心场中蛋白质分子颗粒发生沉降时，它将受到三种力的作用：离心力减去浮力为分子颗粒受到的净离心力：式中mp是分子颗粒的质量（g）；ω是转头的角速度（rad/s）；x是旋转轴心至界面的径向距离（cm）；ω2x是离心加速度；Vp是分子颗粒的体积；ρ是溶剂的密度（g/cm3）；是蛋白质的偏微分比容（偏微分比容：当加入1g干物质到无限大体积的溶剂中时，溶液体积的增量）；Vpρ或是被分子颗粒排开的溶剂的质量；f是摩擦系数；v是沉降速度，即dx/dt。沉降速度法Ⅱ当分子颗粒以恒定速度移动时，净离心力与摩擦力大小相等，方向相反：即整理得等号左边为单位离

6、心场的沉降速度，右边为定值，可见单位离心场的沉降速度是一个定值。将此定值称为沉降系数（sedimentationcoefficient），用s（小写）表示。沉降速度法Ⅲ是logx对t作图所得直线的斜率，因此测得在t1,t2,t3,…时间相应的x1,x2,x3,…，作图求出斜率，代入上式即可求出沉降系数s，沉降系数的单位是秒。沉降速度法Ⅳ蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数介于1×10－13到200×10－13秒之间。为了使用方便，以10－13秒为一个沉降系数的单位，称为斯维得贝格单位（Svedbergunit），或称沉降系数单位，用S（大写）表示。如人

7、血红蛋白的s为4.46×10－13秒，即4.46S。沉降速度法Ⅴ由于测定时温度和溶剂性质对s值都有影响，需要校正成标准条件下的s值，这样才便于比较。标准条件是20℃，溶剂是水。标准条件下的s值记为s20,w。校正公式如下：由于蛋白质浓度增加，分子间可能彼此干扰，使得s值减小。为排除因蛋白质浓度造成的测定误差，可测出一系列在不同浓度蛋白质溶液中的s值，然后外推至浓度为0时的s20,w。蛋白质分子颗粒的质量，爱因斯坦－萨德兰德方程：。式中Mr是蛋白质的分子量，N为阿伏加德罗常数，f为摩擦系数，R为气体常数，T为绝对温度，D为扩散系数。将上述两式代入得沉降速度

8、法Ⅵ此式称为Svedberg方程，代入各种数据可计算出蛋白质的分子量。蛋白质的约