生物化学技术3吸附层析

《生物化学技术3吸附层析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第三章吸附层析层析又称为色谱或色层，是俄国植物学家茨维特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分离纯化方法。其总的原理是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的层析法根据层析类型分，可分为柱层析、纸层析和薄层层析；根据具体分离原理分，可分为吸附层析、分配层析、疏水层析、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等具体层析方法吸附层析（absorptionchromatography）又称色层法或色谱法；是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的一类分离纯化方法吸附层析

2、的概念目的掌握吸附柱层析、薄层层析及聚酰胺薄层层析的基本原理和操作方法层析方法的类型第一节吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相制备成色谱柱，以有机溶剂或缓冲液为流动相，用于分离纯化的一种层析方法吸附柱层析的概念吸附层析的固定相极性:如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等非极性：如活性碳等流动相通常为有机溶剂或缓冲液一、常用术语1．固定相固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质(如吸附剂、离子交换剂)和液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换

3、作用2．流动相在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。在柱层析中又称为洗脱剂或洗涤剂；在薄层层析中又称为展开剂3．层析以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，使有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换，最终使混合物得到分离的过程4．操作容量是反映基质（固定相）对某种成分的结合能力的指标；它表示在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。其数值大，表明基质对某种成分的结合力

4、强；否则反之5．床体积(Vt)是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。它是基质的外水体积(Vo)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和，详见图3-1，即V=Vo+Vi+Vg6．洗脱体积(Ve)是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。用Ve表示(见图3-7中OB)7．外水体积(Vo)外水体积指基质颗粒之间体积的总和8．内水体积(Vi)内水体积是指基质颗粒内部体积的总和9．基质体积(Vg)基质体积是指基质自身所具有的体积。Vo、Vi和Vg都是随着床体积和基质性质变

5、化而变化的10．膨胀度在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积（用Vβ表示）。即每克溶胀基质所具有的床体积一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大11．分配系数是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示12.迁移率指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值。常用Rf表示二、基本原理利用被分离样品中不同组分与吸附剂之间吸附能力的差异（或各组分的分配系数不同）进行分离。吸附能力大（或分配系数大）的组分在柱子上的保留时间长，吸附能力小（或分配系数小）的组分很快被洗脱混合物在层析

6、柱中分离的过程实质上是吸附与解吸附的过程三、吸附剂（一）吸附剂的选择1.具备条件：表面积大、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉等2.选择原则：由吸附剂本身和被吸附物质的理化性质而定。根据“相似相溶”原理，为了便于解吸附（洗脱），对于极性强的分离物，应选择极性小的吸附剂；而对于极性弱的分离物则选择极性强的吸附剂（二）吸附剂的性质20世纪50年代初期，Tiselius等用制备的羟基磷灰石[Ca5(P04)3OH]2（HA）分离蛋白质。目前国内已有商品出售1.羟基磷灰石（1）性质吸附容量高稳定性好（T＜85℃，

7、pH5.5~10.0均可使用）使用广泛（可用于制备和纯化pro、酶、核酸等）分离效果好HA的Ca基团与生物分子表面的负电荷基团的作用，对分离起重要作用；而PO4基团与生物分子表面的正电荷的作用仅起次要作用使用HA作为固定相基质时应注意HA为干粉时，需事先浸泡膨胀达到2~3ml/g后，按1∶6加入缓冲液悬浮，除去细小的颗粒HA悬浮液需用旋涡振荡器混合，因为其他搅拌器如磁棒、玻棒等易破坏其晶体结构忌用柠檬酸缓冲液和pH＜5.5的缓冲液处理色谱柱再生时，先用1mol/LNaCl洗涤，然后用4倍床体积的平衡缓冲

8、液冲洗即可细颗粒HA的操作容量和分辨率均较大颗粒高，但须采用较大直径的柱子2.硅胶（1）性质含水量：含水量高，则吸附性（活性）小，当其表面游离水含量＞17%时，其结合力很小；此时仅能作为分配层析的固定相粒度：粒度小，则分离效果较好（如用200~400目的硅胶能有效地分离多种主物的有效成分）（2）活化：110℃烘烤0.5~1h。活化后立即使用或短期贮存与干燥器中四、洗脱剂条件纯度较高稳定性好能较完全地洗脱下被分离的成分黏度小易和所需的成分分开