生物化学原理杨荣武蛋白质的结构与功能-第5部分

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1、蛋白质的性质及研究方法肌红蛋白晶体1蛋白质的理化性质紫外吸收：最大吸收峰为280nm两性解离：蛋白质的pI值不能直接计算，只能使用等电聚焦等方法进行测定胶体性质沉淀反应：盐析、pI沉淀、有机溶剂引起的沉淀和重金属盐作用造成的沉淀变性、复性水解颜色反应2蛋白质变性蛋白质受到某些理化因素的作用，其高级结构受到破坏、生物活性随之丧失的现象。导致蛋白质变性的物理因素有：加热、冷却、机械作用、流体压力和辐射；化学因素有强酸、强碱、高浓度盐、尿素、重金属盐、疏水分子和有机溶剂。蛋白质变性以后，其理化性质发生一系列的变化。这些变化可以作为检测蛋白质变性的指标。主要的变化包括：（

2、1）溶解度降低。（2）粘度增加。（3）生物活性丧失。（4）更容易被水解。（5）结晶行为发生变化。3蛋白质的水解蛋白质在强酸、强碱或蛋白酶的催化下均能够发生水解。但需要注意的是，酸水解会破坏几种氨基酸，特别是Trp几乎全部被破坏，其次是三种羟基氨基酸。另外Gln和Asn在酸性条件下，容易水解成Glu和Asp。酸水解常用硫酸或盐酸，使用最广泛的是盐酸；碱水解会导致多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象，但不会破坏Trp；酶水解效率高、不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，但由于不同的蛋白酶对肽键特异性不一样，因此，由一种酶水解获得的通常是蛋白质的部分水解产物。4四种

3、羧肽酶来源和特异性5几种蛋白酶特异性的比较6反应名称反应试剂颜色用处双缩脲反应硫酸铜，碱性溶液紫红色（540nm）定量测定蛋白质黄色反应硝酸先产生白色沉淀，加热变黄，再加碱呈橙黄色鉴定含有芳香族氨基酸的蛋白质米伦氏反应硝酸、硝酸汞、亚硝酸、亚硝酸汞混和液先是白色沉淀，加热后变成红色鉴定含有Tyr残基的蛋白质乙醛酸反应乙醛酸、浓硫酸紫色环鉴定含有Trp残基的蛋白质坂口反应次氯酸钠、α-萘酚、氢氧化钠红色鉴定含有Arg的蛋白质福林反应磷钼酸、磷钨酸蓝色Lowry法鉴定含有Tyr残基的蛋白质醋酸铅反应醋酸铅黑色含有Cys的蛋白质考马斯亮蓝结合反应考马斯亮蓝G-250酸性

4、溶液蓝色Bradford法定量测定蛋白质蛋白质的各种颜色反应7蛋白质研究方法假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质X1.如何得到这种蛋白质?蛋白质的分离、纯化技术2.这种蛋白质的大小？（SDS-PAGE）3.它的pI是多少？（等电聚焦）4.其他细胞或其他生物体内是否存在？（Western印迹）5.其一级结构如何？（序列分析）6.其三维结构又如何？X-射线衍射和核磁共振8蛋白质纯化一、准备工作要解决三个问题：（1）纯化蛋白质的目的；（2）目标蛋白的测活方法；（3）纯化蛋白质的原料。二、纯化步骤：（1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；（2）去除残渣（离心）；（3）沉淀/浓缩（

5、硫酸铵或聚乙二醇）；（4）纯化（层析）；（5）鉴定910等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质，以在阳极和阴极之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的作用下迁移，最后各自移动到并聚焦于与其pI相当的pH位置上。于是通过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分离，而且还可以测定出各种蛋白质的pI11蛋白质的双向电泳12Western印迹13蛋白质一级结构的测定直接测定法间接测定法。先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。14测定步骤主要试剂和方法备注1详见蛋白质的纯化2极端pH；8mol/L尿素；6m

6、ol/L盐酸胍；高盐(常用硫酸氨)。如果肽链之间以二硫键相连，可使用步骤3的方法进行拆分。3过甲酸氧化法；巯基类还原剂还原法：巯基乙醇；二硫苏糖醇（DTT）或二硫赤藓糖醇。第二种方法需要使用烷基化试剂，如碘代乙酸，防止二硫键从新形成。4氨基酸自动分析仪为步骤6和7选择合适的裂解法提供有用的信息。5N-端测定：Sanger试剂法；丹磺酰氯法；PTIC或其衍生物测定法。C-端测定：肼解法；还原法：使用硼氢化纳将C-端氨基酸残基转变成氨基醇，而将它与其它氨基酸区别开来。羧肽酶法（羧肽酶A、B，参考表4-2）如果N-端氨基被封闭，不能直接使用表中的方法，需要根据可能的封闭

7、类型，区别对待。如果氨基是被甲酰或乙酰化封闭的，需要先将甲酰基或乙酰基水解。如果氨基是被焦谷氨酰化封闭的，可以使用专门水解焦谷氨酸残基的焦谷氨酸氨肽酶，直接进行分析。6酶解法；化学裂解法（BrCN）7同上8蛋白质序列自动分析仪；质谱法片段重叠自动分析仪的原理为Edman降解9对角线电泳蛋白质一级结构测定的主要步骤15