生化实验04-淀粉酶活性的测定-陈桃

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1、相关知识点回忆NRERE直链淀粉支链淀粉或糖原分支点的结构RENRE(16)分支点支链淀粉或糖原分子示意图直链淀粉的螺旋结构0.8nm1.4nm6个残基1.重要的多糖-淀粉支链淀粉的分枝结构开始分枝的残基非还原端残基两个葡萄糖单位之间的1，6-糖苷键两个葡萄糖单位之间的1，4-糖苷键a-淀粉酶β-淀粉酶切α-1,4-糖苷键淀粉的水解麦芽糖酶酶促脱支酶切α-1,6-糖苷键降解异麦芽糖酶磷酸解:淀粉磷酸化酶2、淀粉的酶促降解3.淀粉的酶促水解淀粉酶α－淀粉酶：在淀粉分子内部任意水解α-1，4糖苷键。产物为麦芽糖，麦芽三糖，糊精等还原糖（内切酶）β－淀粉酶

2、:从非还原端开始，水解α－１，4糖苷键，依次水解下一个β－麦芽糖单位（外切酶）α－淀粉酶β－淀粉酶极限糊精α-淀粉酶β-淀粉酶可跨越分枝点　　　不能跨越分枝点内切酶（随机切）　　端解酶（非还原端两两相切）产物糊精分子量小　　糊精分子量大（极限糊精）耐70℃15min,不耐酸耐pH=3.3酸性,不耐高温分布发芽种子休眠种子α-淀粉酶和β-淀粉酶的异同点：相同点：都作用于α-1,4糖苷键，产物都是麦芽糖不同点：淀粉酶活性的测定（P174）实验04一、目的二、原理淀粉α-淀粉酶（内切酶）β-淀粉酶（外切酶）麦芽糖等寡聚糖麦芽糖3，5-二硝基水杨酸3-氨基-5-硝基

3、水杨酸（棕红色）淀粉酶的作用机制及产物显色原理：D-麦芽糖淀粉酶活性大小的表示方法：淀粉酶活性的大小与产生的还原糖的量成正比。以单位质量样品单位时间生成的还原糖的量表示。测定α-淀粉酶和β-淀粉酶：α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐热，本实验采用70。C保温15min钝化β-淀粉酶而测出α-淀粉酶。总活力减去α-淀粉酶活力则为β-淀粉酶活力。三、材料、仪器设备及试剂材料：萌发的小麦种子（芽长1cm）仪器设备：分光光度计、恒温水浴、刻度试管、容量瓶试剂：1、标准麦芽糖溶液（1mg/mL）2、3，5-二硝基水杨酸（含NaOH）3、1%淀粉溶液四、实验步骤2、酶液制

4、备称取1g萌发的小麦种子加少量蒸馏水研磨转入100mL容量瓶定容放置15min过滤淀粉酶原液（酶液Ⅰ）取酶液Ⅰ10mL于50mL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液（酶液Ⅱ）1、麦芽糖标准曲线的制作A540=0.264x-0.052(x为mg麦芽糖）3、酶活力的测定取4支干净的具塞刻度试管，编号，按下表操作：摇匀，沸水浴中5min，取出流水冷却，加蒸馏水至20mL。摇匀，540nm比色测定。操作项目管号Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅱ-1Ⅱ-2淀粉酶原液（酶液Ⅰ）/mL1.01.000钝化β-淀粉酶置700C水浴中15min，取出后流水冷却淀粉酶稀释液（酶液

5、Ⅱ）/mL001.01.03，5-二硝基水杨酸/mL2.002.00预保温400C恒温水浴中保温10min1%淀粉溶液/mL（40。C）1.01.01.01.0保温400C恒温水浴中保温5min3，5-二硝基水杨酸/mL02.002.0空白管：2mL蒸馏水+2mL3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，定容至20mL五、实验数据VT=VS=W=AⅠ-1=AⅠ-2=△A1=AⅠ-2-AⅠ-1x1=AⅡ-1=AⅡ-2=△A2=AⅡ-2-AⅡ-1x2=六、结果计算X1×VTα-淀粉酶活力[mg/(g.min)]=W×VS×tX2×VT×N(α+β)-淀粉酶活力[mg

6、/(g.min)]=W×VS×tβ-淀粉酶活力=(α+β)-淀粉酶活力-α-淀粉酶活力七、分析讨论注意事项：1、三个水浴温度的不同，不能混淆。2、实验步骤较复杂，理解之后动手操作。