环境微生物学微生物的生长与代谢

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1、环境微生物学环境与公共卫生学院第3章微生物的生长与代谢第三节环境微生物的生长繁殖微生物纯培养技术微生物的生长繁殖(1)分　　离(2)培　　养(3)纯培养的保存与复壮一、微生物纯培养的概念实验室条件下，由一个微生物细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。二、微生物纯培养技术纯培养基本步骤：(2)培　　养(1)分　　离无菌技术分离、纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术，它是保证微生物学研究正常进行的关键。接种操作用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下

2、把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。用固体培养基分离纯培养不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板(cultureplate)的简称，它是指熔化的固体培养基倒

3、入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。固体培养方法可将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基(用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基)，可使每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。Koch建立的平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。稀释倒平板法涂布平板法平板划线分离法单细胞挑取法纯培养方法1.稀释倒平板法待分离的材料用无菌水作一系列的稀释，取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能

4、含菌的琼脂平板，保温培养一定时间，可能出现在平板表面或琼脂培养基中的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。二、微生物纯培养技术二、微生物纯培养技术1、稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。基本过程：（1）梯度稀释过程；（2）分离培养过程涂布倾注梯度稀释过程10-110-210-310-410-510-64)操作要点：无菌操作稀释平板分离法使用过程中的几个问题1)梯度稀释度的确定：需分离微生物在样品中的数量2)选择菌落接种的依据：a、菌落特征；b、菌体的特征3)微生物纯培养的标准：菌落特征一致性2.涂布平板法在微生物

5、学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒人无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。二、微生物纯培养技术3.平板划线分离法用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。二、微生物纯培养技术平板划线分离法（StreakPlate）特点：快速、方便。分区划线（适用于浓度较大的样品

6、）连续划线（适用于浓度较小的样品）4、单细胞挑取法：从待分离材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养的过程。二、微生物纯培养技术单细胞(单孢子)分离采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞(单孢子)分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。三、目标微生物纯培养筛选的基本思路１、待分离样品的确定２、培养基的选择３、纯化过程环境条件的控制（温度、空气、PＨ、抑制剂）（Ｐ１３８－１４１）（一）纯培养的保存试管斜

7、面培养基低温、干燥、隔绝空气四、纯培养的保存与复壮1、灭菌彻底2、棉塞大小要合适3、无菌操作保存过程的注意点：防止杂菌污染。通过分离纯化得到的微生物纯培养物，必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡，不会被其他微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。菌种或培养物保藏是一项最重要的微生物学基础工作，微生物菌种是珍贵的自然资源，具有重要意义。传代培养保藏常用的有琼脂斜面、半固