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1、全内反射荧光显微镜发展历史优势应用分型及结构基本原理发展与展望细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。发展历史荧光显微镜的概念在细胞生物学方面，传统光学显微镜始终不能解决生物样本显微中的几个重要问题：1.显微图像的信噪比不高；2.光源对生物样本照射的损伤；3.光学衍射所致的分辨极限（R≥0.61λ/nsinθ）：传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应
2、的影响,存在分辨极限,瑞利将之归纳为R≥0.61λ/nsin(u/2),其中R为分辨力,λ为成像光波波长,nsin(u/2)为物透镜的数值孔径,即NA值，u为孔径角,因此光学显微镜空间分辨极限～250nm。发展历史全内反射荧光显微术的发展历程近年来人们开发出了一系列光学显微镜。其中，全内反射荧光显微术(Totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy,TIRFM)是近年来新兴的一种光学成像技术。全内反射荧光显微术的发展历程Hirschfield完成了第一个全内反
3、射荧光实验1965年Axelrod等生物物理学家对TRIFM技术及基本原理进行描述，并探索了其生物应用。20世纪80年代早期20世纪90年代新型物镜透镜、聚光镜和超灵敏探测器的出现，使TRIFM技术得到充分发展。1995年Yanagida小组用TIRFM技术首次在液体溶液中得到了荧光标记的单个蛋白质分子的成像。该项技术已经应用到许多单分子的研究中这是首次尝试用全内反射荧光法测液体中的单个分子的荧光。将全反射理论与生物细胞的荧光成像技术相结合是一种全新的突破。肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生，荧光标记驱
4、动蛋白动态研究。1996年Moerner小组又用这项技术实现了限制在丙烯酰胺胶体的纳米孔中的单分子的三维成像。至今基本原理全内反射荧光显微镜的基本设计思路全内反射荧光显微镜的基本原理全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波激发样品,从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面，单分子的活动情况。这种方法的成像装置简单，极易和其它成像技术、探测技术相结合，目前已成功的实现100nm甚至更低的空间分辨率。基本原理全内反射荧光显微镜的基本设计思路全内反射荧光
5、显微镜的基本原理荧光激发原理荧光捕捉原理snell定律:n1sinθ1=n2sinθ2当n1大于n2时，全反射就可能发生:θ2=90°θc=sin-1(n2/n1)即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射全内反射荧光激发原理沿着入射面上的介质边界传播在平行界面方向以平行波场方式传播在垂直界面方向则是呈指数衰减。隐失波的强度-深度图隐失波荧光激发原理非均匀波透射强度和浸透深度公式T12（θi）-分界面处的透射强度d12-渗透深度θi-入射角λ-入射光波长隐失波对于可见光波长380～780nm而言，浸透深
6、度为～100nm。荧光激发原理箭头表示激光的方向，激光被全反射，同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子，白色小圆点表示未被激发的荧光分子。荧光捕捉原理CCD相机CCD相机的高灵敏度特点使全内反射荧光显微镜利用消逝波照射样品并使其成像成为可能，也成就了其高信噪比。CCD相机的快速成像特点提高了其时间分辨率，使得观察单分子的运动、细胞物质的分泌、蛋白质的相互作用成为可能并成为这方面的优势观察仪器。目前使用CCD探测,可达到的量子产率已到～80%,成像速率～200Hz.当对活
7、细胞成像时,为了达到单分子级的灵敏度或是为了减少曝光时间,需要采用图像增强器。荧光捕捉原理全内反射显微镜的分型及其结构全内反射荧光显微镜根据其成像系统的不同可分为棱镜型和物镜型两种类型两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统，1）为棱镜型，2）为物镜型。（一）棱镜型全内反射荧光显微镜利用激光经过棱镜并产生全内反射，其消逝波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被CCD相机捕捉。棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图评价棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光光源、棱镜和显微镜。在探测上，它也不容
8、易受到入射光信号的干扰。放置样品的空间受到棱镜的限制。（二）物镜型全内反射显微镜收集样品荧光信号的接收器显微镜的物镜发生全内反射的光学器件。由于细胞的典型折射率为1.33～1.38,因此要想实现全内反射,物镜的NA必须大于1.38。表达式为：NA=nsin（u/2）nsin（u/2）>nsinθcNA为物镜的数值孔径,n,u分别为物镜的折射率(浸没油)和孔径角。θc为发生全反射的临界角。二者比较棱镜型全内反射荧光显微镜物镜型全内反射荧光显微
