全内反射荧光显微术

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1、第22卷第4期物理学进展Vol.22,No.42002年12月PROGRESSINPHYSICSDec.,2002文章编号:1000O0542(2002)04O0406O10全内反射荧光显微术王琛,王桂英,徐至展(中国科学院上海光学精密仪器研究所强光光学开放实验室,上海　201800)摘　要:　全内反射荧光显微技术是当今世界上最具前途的新型生物光学显微技术之一,可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。它利用全内反射产生的隐失波照明样品,使照明区域限定在样品表面的一薄层范围内,因此具有其它光学成像技术无法比拟的高的信噪比和对比度。近年来,已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光

2、成像中。本文系统的介绍了全内反射荧光显微技术的原理、国内外的发展和现状及其在生物学上的应用,并对其未来做了展望。关键词:　单分子探测;荧光分子;全内反射荧光显微术;隐失波中图分类号:TH742.65文献标识码:A0　引　言1590年,Z.Janssen和H.Janseen共同研制出世界上第一台光学显微镜。在随后的几百年间,显微科学取得了迅猛的发展。人们逐渐地改进了成像质量,而且各种新的光学显微镜也应运而生,如偏振光显微镜、相差显微镜、倒置显微镜。但是传统的光学显微镜由0.61λ于受到光瞳远场衍射效应的影响,存在分辨极限,瑞利将之归纳为R≥,其中λ为nsinθ成像光波波长,n

3、sinθ为物透镜的数值孔径,即NA值。因此,对可见光来说,光学显微镜空间分辨极限～250nm。从应用的角度,传统的光学显微术无法满足更高的分辨率要求。生命科学中大量的事实表明细胞的动力学特征是起源于单个蛋白质分子的聚合和相互作用,这就要求发展超高分辨率的成像技术,从而在分子尺度上探测细胞生命活动的细节。在这种需求下,20世纪30年代电子显微镜发展起来。它导致了细胞研究的革命,使得生物学家得以从亚显微水平上认识细胞世界。进入80年代,非光学类扫描探针显微术特别是原子力显微镜的出现更是将成像的分辨率推进到纳米的精度。但是这些显微术均收稿日期:2002O09O10基金项目:上海市

4、科学技术发展基金(01DJGK018),国家自然科学基金(No.60078025)以及国家科技部重大基础研究基金的资助(G1999075200)4期王琛等:全内反射荧光显微术407在不同程度上存在系统结构复杂、成像检测环境要求苛刻等困难,尤其是不能象光学显微术那样提供重要的光学信息(如偏振态、折射率、光谱等)和进行无损伤性生物活体探测,这些均严格限制了它们在高分辨率细胞成像中的应用。与此同时,新一代光学显微技术发展起来。它们以其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对单分子活体探测的可行性,再次成为生物学家、物理学家和成像学家们研究的热点。目前国际上公认的最有前途的单分子

5、光学成像技术有全场相衬显微术、共焦[1,2]荧光显微术,近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术。这些技术在分子生物学、分子化学、激光医学及纳米材料等领域受到广泛关注,并产生了深远的影响。其中,全内反射荧光显微术是近年来新兴的一种光学成像技术,它利用全内反射产生的隐失场来照明样品,从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比很高。这种方法的成像装置简单,极易和其它成像技术、探测技术相结合。目前已成功的实现100nm甚至更低的空间分辨率。1原理[3,4]1.1全内反射的基本理论1.1.1全内反射全内反射是一种普遍存在的光学现象。考虑一束平面光波从玻璃表面进

6、入到溶液中。入射光在玻璃表面上一部分发生反射,另一部分则透射进溶液。入射角和透射角之间满足关系式n1sinθ1=n2sinθ2(1)这里n1是玻璃的折射率,n2是液体溶液的折射率。当入射角增大,增大到临界角θc时,这时的透射角为90°;当入射角继续增大到大于临界角时,光不再透射进溶液,也就是发生了全反射,如图1所示。由snell定律可知θ2=90°-1n2θc=sin()(2)n1由上式可知,当n2

7、角度来看,当光发生全反射时,光会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上,由于波动效应,有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中,平行于界面传播。这部分光场就是所谓的隐失波。1.1.2隐失波现在考虑一束单色光,横截面光束强度是Ii,图1全内反射示意图以大于临界角的角度θi入射到电介质上。分界面408物理学进展22卷处的受限光场,即隐失波场的强度成指数衰减(在低折射率的介质中)。如图2所示ZT(Z,θi)=T12(θi)exp(-)(3)d12(θi)T12(θi)是分界面处的透射强度,Z是离开分界面的距离。d1