流式细胞分析分选原理

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1、流式细胞仪工作原理流式细胞术的原理流式细胞术（FCM）是一种能对单个细胞、分子和生物颗粒（微生物）进行多参数快速检测的新型分析和分选技术。近几年随着多种单克隆抗体的成功制备和多种荧光素的应用。FCM逐步运用于对疾病诊断和治疗监测的临床检验常规工作。流式细胞仪与显微镜光源激光自然光、灯光、氙(汞)灯对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子承载工具载(盖)玻片鞘液及流动室检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT，放大电路目镜X物镜统计人工，200计算机，>5000结果简单，单参数多参数，综合分析基本原理流路流动室鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬

2、液5*105~1*106个/ml光路光源检测信号光电倍增管PMTHV电路放大电路HV及GAIN增益A/D转换统计：计算机流式细胞仪光路流路电子软件流路光路电路/电子软件流路单细胞悬液大多数仪器是在50-300µm大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中这一过程,成为流体动力学聚焦FLOWCELLInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流路光路电路/电子软件光路光源检测信号散射光信号FS:前向角散射光SS:侧向角散射光(90度散射光)荧光信号荧光染料光学滤片颜色补偿光路光源

3、与通过的细胞聚焦在同一点上激光空冷488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,水冷Innova300系列Innova70系列固态检测信号散射光信号—前向散射光(FS)FS----Forward(AngelLight)Scatter在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测器FS的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及opticalhomogeneity有关FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性如:大小前向散射光散射光信号–侧向散射光SS-Side(AngelLight)Scatter与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器

4、,也称为90度散射光检测器SS的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及opticalhomogeneity有关SS用于检测细胞内部结构如:胞浆内颗粒多少,核质比侧向散射光90DegreeScatter02004006008001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionLightScatterGatingScale光路-荧光信号每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.利用各种不同波长的光

5、学滤片来收集(检测)这些光学信号荧光染料的特性激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)Fluorescenceemittedbyeachfluorochromeisusuallydetectedinauniquefluorescencechannel.Thespecificityofdetectioniscontrolledbythewavelengthselectivityofopticalfiltersandmirrors.Absorptionspectrum:Rangeoverwhichafluorescencecomp

6、oundmaybeexcitedEmissionspectrum:Rangeofemittedwavelengthsforaparticularcompound5ColorSingleLaser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC74ColorSingleLaser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5常用荧光染料的特性荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色

7、橙红PECy7488755免疫荧光深红PerCP488670APC633670光路-滤片特性当以45o角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光这种方式的滤片称为二向色性滤片(dichroicfilter)标准带通滤片bandpass光源通过的光谱630/30nmBP615-645nmlightSourcelightPassedlightCertaincolorsabsorbedAbsorbancefilter488DL488BK550DL525BP600DL575BP640DL620BP675BPUniqu

8、e4-ColorSingleLaserDesignAir-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQu