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1、植物细胞转化的方法种类及特点植物转基因技术的一般操作过程间接转化法：农杆菌介导法病毒介导法植物基因转化技术方法DNA直接转化法：基因枪法电击法花粉管通道法化学物质诱导法显微注射法脂质体法间接转化法是以生物体为媒介的植物转基因方法,有农杆菌介导法和病毒介导法。间接转化法农杆菌介导法是以农杆菌为媒介对植物进行遗传转化的方法。1.农杆菌介导法它是通过根癌农杆菌的Ti质粒(Tumerinducingplasmid)和发根农杆菌的Ri质粒(Rootinducingplasmid)上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中,T
2、-DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。T-DNA能够进行高频率的转移,而且Ti质粒和Ri质粒上可以插入到50kb的外源基因,因此Ti质粒和Ri质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。T-DNA可以将其携带的外源基因整合到植物基因组中，T-DNA上较重要的是T区两端左右边界各为25bp的重复序列。其中14bp是中心,分10bp和4bp两组,是完全保守的。这两个边界是T-DNA转移所必需的。其中尤以右边界最为重要。T-DNAvir基因Ti质粒的vir区大小为30kb,分VirA、B、C、D、E、G、H等7个操纵子,一共
3、有24个基因共同控制着T-DNA的加工和转移,它们总称调控子。叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡筛选培养基愈伤组织分化幼苗优点：技术较成熟,转化效率高操作简单，不需要特殊仪器，培养周期短外源基因多以单拷贝或低拷贝插入受体细胞,稳定性好，减少了共抑制等基因沉默现象。可将较大片段DNA完整地转移到植物基因组中等。缺点：主要转化双子叶植物。T-DNA可以在植物染色体的任何区域内插入,有可能导致有益基因的插入失活。迄今所获得的近200种转基因植物中80%以上是通过根癌农杆菌系统转化获得的。病毒介导法是以病毒为媒介对植物进行遗传转化的载体系统
4、。具体来说就是将外源基因插入到病毒基因组中,通过病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入植物细胞的一种植物转基因方法。2.病毒介导法利用植物病毒介导法对植物基因进行遗传转化效率比较高,但它的安全性受到质疑,主要用于动物的基因转移。直接转化法(又称DNA直接导入法),它指不依赖于生物体将裸露的DNA直接转移到植物细胞和原生质体中,导致细胞转化的技术,与间接转化法相比,直接转化法不需构建载体,因此又叫无载体介导转化法。它适用于对农杆菌侵染不敏感的植物,使用此法的前提是需要建立良好的细胞或原生质体培养及再生系统。DNA直接转移法DNA
5、直接导入法最大的优点是无需选择宿主,可以导入生物细胞；缺点是嵌合基因整合进宿主染色体的频率低。该方法可以分为化学物质诱导法、电穿孔法、脂质体法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法和花粉管通道法。基因枪法电击法花粉管通道法化学物质诱导法显微注射法脂质体法基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，最后整合到植物基因组并得以表达从而实现基因转化的方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。1.基因枪法DNA1.2m钨弹头吸附特制手枪射击
6、植物装入优点：克服了受体材料的限制，不必制备原生质体。实验操作简单易行，适合于大多数细胞或组织，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。缺点：进去的DNA片段整合效率极低，遗传稳定性差，拷贝数多，不易获得再生植株。至今为止,该法已成为除了农杆菌介导转化法以外应用最广泛的基因转移技术。此法已在葡萄、水稻等植物转基因中应用,并获得转基因植株。基因枪法也可以有效地用于叶绿体的转化，还可以转移RNA、DNA克隆等。是在高压电脉冲作用下在新鲜分离的原生质体的质膜上形成瞬时可逆性开放小孔,为外源DNA提供通道,借此导
7、入DNA等遗传物质,达到转化的目的。由于质膜具有可修复性,外加电压造成的膜穿孔可在一定的时间内自动修复,从而使细胞恢复到正常的生理状况。2.电击法植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2kV,3-25F电击愈伤组织幼苗分化优点：操作简便，可以一次转化许多原生质体，转化效率较高，特别适于瞬间表达。缺点：有原生质体培养的麻烦,电穿孔易造成原生质体损伤使再生率降低。该法已在甘蔗、大麦小孢子、剪股颖等植物的基因转化当中。花粉管通道法是利用植物授粉后,所形成的天然花粉管通道,经珠心通道,将外源DNA携带入胚囊,从
8、而达到转化目的的一种植物转基因方法。3.花粉管通道法优点：适用范围广，不依赖组织培养人工再生植株；可直接获得转基因种子，育种时间短，在鉴定时可直接针对目的性状的表现型来进行,简单快捷；转化速度较快，变异性状稳定较快；方法简单,不需要复杂昂贵的仪器设备。缺点：转化受体受植物花期的限制，同时必
