生化分离工程实验

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1、生化分离工程实验指导老师：何进教授电子邮箱：hejinhzau@yahoo.com.cn联系电话：13971107550助教学生：赵有文zhaoyouwen1987@yahoo.com.cn刘舒liushude101@163.com胡轶敏huyimin11@163.com危雅乐yale.happy@163.com1组李佳佳（组长）董奇峰吴婷婷杨后召2组范文瑾（组长）谢贻天熊雅琪罗文3组刘小翠（组长）张箐郑琦孟庆4组罗云超（组长）刘浩宇黄玮李智5组唐清（组长）李斌严楠峰柴芝培6组白腾龙（组长）伍良伟余乐裴媛筠7组邹铮铮（组长）刘娟尹学琳王海云8组赵鹏（

2、组长）张灵芬潘丽娜余晓岚菌株的优化培养总DNA或RNA的抽提PCR或RT-PCR扩增目的基因乙醇沉淀回收线性化片断大肠杆菌表达载体pET-28酶连产物转化E.coliDH5挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证)检索感兴趣的基因（hfq/fabz）直接优化并合成连T载测序重组表达质粒转化E.coliBL21挑取重组子,用菌落PCR方法验证IPTG诱导促使目的大量蛋白表达细胞破碎及蛋白抽提目标蛋白的纯化蛋白质浓度测定--Bradford法目标蛋白的鉴定—Westernbiotting结晶结构解析本次试验内容本次试验的主要内容His-Tag

3、系统JH022菌株（含fabZ基因）0.3mMIPTG诱导超声破碎，过淀粉柱，纯化蛋白采用Bradford法测蛋白浓度切下MBP标签，SDS-PAGE验证BL21菌株（含hfq基因）1mMIPTG诱导超声破碎，过Ni-NTA柱纯化蛋白跑SDS-PAGE鉴定pMAL系统无细胞体系目的基因的背景资料HfqfabZHfq是一个高度保守的RNA结合蛋白，最初被发现是作为大肠杆菌RNA噬菌体Qβ复制所必需的管家因子。现在则被认为是细菌基因转录后调控的关键因子，广泛参与细菌多种生命活动的调控。大肠杆菌fabZ基因编码3-羟基脂酰ACP脱水酶，是大肠杆菌中的必须基

4、因，该基因的突变会导致细菌细胞的死亡。生化分离工程实验（星期五）一，接种按1%的接种量将两种菌株分别加入到含抗生素的LB培养基中,做好标记（写清组号，菌株信息、抗性），统一放于第八组台面。系统His-Tag系统pMAL系统菌株编号HAZJH022宿主菌大肠杆菌BL21大肠杆菌DH5α目的基因hfqfabZ培养基LB培养基LB培养基接种量1%（2ml）1%（2ml）加入抗生素Kan（200ul）Amp（200ul)生化分离工程实验（星期五）将超净台内PA瓶中剩余的菌液用枪吸取200µl于1.5ml离心管中，10000rpm/min离心1min，弃上清，

5、加入200µl的无菌水洗涤菌体上残留的培养基10000rpm/min离心1min，弃上清，然后重悬于40µl灭过菌的去离子水中，100℃煮15min，10000rpm/min离心1min，取上清9.2µl作为菌落PCR的模板。二，菌液PCR（验证目的基因已转入宿主菌中）PCR体系H2O9.2µl10XPCRbuffer2.5µldNTP2.0µl上游引物0.5µl下游引物0.5µlTaq酶0.3µl模板10µl总体积25µlPCR程序95℃5min95℃35s56℃40s72℃60s72℃10min25℃10minCycle30注：用质粒做阳性对照，

6、水做阴性对照，不用重复，PCR管上做好标记！ThepMAL-c2seriesofvectorshaveanexactdeletionofthemalEsignalsequence,resultingincytoplasmicexpressionofthefusionprotein.ThepMAL-p2seriesofvectorscontainthenormalmalEsignalsequence,whichdirectsthefusionproteinthroughthecytoplasmicmembrane,andthefusionprotein

7、scanbeexportedtotheperiplasm表达系统His-TagpMAL菌株HAZJH022培养温度37℃37℃转速200rpm/min200rpm/min适宜状态OD600=0.6OD600=0.5所需时间2.5h2.5h加入IPTG的终浓度1.0mM(2ml)0.3mM(0.6ml)三，诱导注：在加入IPTG之前，摇匀菌液并各取1ml于1.5ml的离心管中，做好标记（组号，菌液名）记作“诱导前”，放于第八组桌面的离心管板中，于—20℃保存。四，配试剂五，PCR结果依据每组发的纸条进行生化分离工程实验（星期五）将加入诱导剂后的菌液再放

8、入37℃200rpm/min的摇床中诱导培养4-5小时后收集菌体。菌株HAZJH022沉淀（离心管对应配平）