《酯酶与氧化酶》PPT课件

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1、酯酶Esterase一、基本概念1.定义：酯酶(Esterase),催化作用于酯类物质的酯健,使之水解的酶的总称,包括磷酸酶,羧酸酯水解酶,硫酸酯水解酶等。羧酸酯水解酶(Carboxylicesterhydrolase)，是所有能催化羧酸酯水解的酶的总称（或称酯酶），其作用是水解脂肪族酯和芳香族酯，催化的反应式：羧酸2.酯和酯键酯由来自羧酸的酰基和来自醇的烃氧基组成，是羧酸与醇反应失水而生成，即羧基上羟基和醇羟基上的氢共同脱水。通式R-CO-OR`，结构上可看作羧酸中的羟基被烃氧基（-OR`）取代的产物，亦可看作醇中羟基的氢原子被酰基（R-CO-）取代的产物。羧

2、酸酰基（R-CO-）是含氧酸分子（RCOOH）中去掉酸性OH后（即能离解出H+的OH基）余下的基团。包括丙酰基(丙酸）、苯甲酰基（苯甲酸）、草酰基（草酸）、苯磺酰基（苯磺酸）、亚硝酰基（亚硝酸）、亚硫酰基（亚硫酸）、磷酰基（磷酸）。3.酯酶与水解反应羧酸酯酶水解羧酸酯为醇和羧酸芳香酯酶水解乙酸苯酯为酚和乙酸脂肪酶水解甘油三酯为甘油二酯和脂肪酸乙酰酯酶水解乙酰酯为醇和乙酸乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱为胆碱和乙酸胆碱酯酶水解酯酰胆碱为胆碱和羧酸根据酶对底物、pH、激活剂、抑制剂的反应特点，可将酯酶分为20余种，在生物化学上统称为酯酶，只有一部分可用组化的方法证明。通常根

3、据对底物是否具有特异性，可分为特异性与非特异性酯酶两种。分解短链（C2～C4）低级脂肪酸酯多为非特异性酯酶，如芳香基酯酶、羧酸酯酶和乙酰酯酶。特异性酯酶据其底物特异性可分为，分解长链(C8以上）高级脂肪酸酯的酶称酯酶(Lipase)，分解乙酰胆碱的乙酰胆碱酯酶，分解酯酰胆碱的胆碱酯酶。二、酯酶的分类（一）非特异性酯酶(non-specificesterase)：无底物特异性。根据E600,DFP,PCMB对它们的抑制作用不同，分为3类.1.芳香基酯酶(Aromesterase)，即A-酯酶，亦称有机磷酸抵抗性酯酶I。（１）底物：－萘酚乙酯萘酚ＡＳ乙酸酯类吲哚

4、酚乙酸酯类（２）完全抑制①10mmol/L磷酸二乙基对硝基苯酯(E600)②1mmol/LCuSO4③1mmol/LPb(NO3)2④10mmol/LAgNO3⑤100mol/L对氯高汞苯甲酸(PCMB)（３）激活１mmol/L半胱氨酸(Cysteine)２、脂肪族酯酶（aliesterase),即B-酯酶，亦称有机磷酸敏感性酯酶（１）底物－萘酚乙酯；萘酚ＡＳ乙酸酯类；吲哚酚乙酸酯类。（２）完全抑制10mol/L磷酸二乙基对硝基苯酯(E-600)100mol/L毒扁豆碱(Eserine)10mmol/LAgNO3３.乙酰酯酶(acetylesterase

5、)：即C-酯酶，又称有机磷酸抵抗性酯酶Ⅱ（１）底物吲哚酚乙酸酯类萘酚AS乙酸酯类（２）完全抑制10mmol/L-苯丙酸10mmol/LAgNO31mmol/LCuSO4（３）激活100mol/L对氯高汞苯甲酸(PCMB)100mol/L苯氯化汞非特异性酯酶A酯酶B酯酶C酯酶别称芳香/芳基酯酶,有机磷酸抵抗性酯酶Ⅰ羧酸酯酶,芳香族酯酶,有机磷酸敏感性酯酶乙酰酯酶,-SH抑制性抵抗性酯酶,有机磷酸抵抗性酯酶ⅡE600(10-4mol/L)抑制PCMB(10-4mol/L)抑制激活（二）特异性酯酶(Specificesterase)根据底物的特异性分为三种:１、

6、脂酶(Lipase)底物：高级脂肪酸抑制剂：毒扁豆碱(eserine)激活剂：2.5%牛磺胆酸钠２、胆碱酯酶(cholinesterase)特异性底物：丁酰硫代胆碱抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA)3、乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase)底物：乙酰－－甲基硫代胆碱乙酰硫代胆碱３－乙酰基－５－吲哚重氮盐抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA)酯酶的鉴别１、根据底物特异性选择特异底物配制孵育液２、选择一定浓度的抑制剂或激活剂通常使用抑制剂的方法是向底物液中加抑制剂或将切片在抑制液中浸渍。（一）显示法A.偶氮色素法１、反应原理在

7、酶作用下，从底物游离出来的-萘酚AS与重氮盐偶联形成偶氮色素，同时沉着于酶的存在部位，通过偶氮色素显色，间接证明酶的存在部位。-萘酚系统可用重氮盐坚牢蓝Ｂ，坚牢蓝RR，坚牢红RC盐。萘酚AS系统用柘榴石（黄色）、GB盐、坚牢红RC、坚牢红紫LC盐。三、非特异性酯酶2.孵育液（萘酚AS乙酸酯法Pearse,1972）1%萘酚AS醋酸盐（丙酮溶液）0.1ml(底物）0.05mol/LPBS(pH7.0)10ml（缓冲液）坚牢蓝B盐30mg（重氮盐）搅拌过滤使用3.操作步骤(1)新鲜组织恒冷箱切片；(2)入孵液，室温或37℃20-30min；(3)流水冲洗2min

8、；(4)2%甲基绿复染细