选修1_生物技术实践

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1、第一部分  微生物的利用平阳中学生物组高翔平阳中学生物组高翔实验1大肠杆菌的培养和分离基本要求1．进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2．进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。发展要求说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。教学要求大肠杆菌1、革兰氏阴性2、异养兼性厌氧肠道杆菌4、基因工程中被广泛应用①大肠杆菌质粒——载体②大肠杆菌——受体细胞3、繁殖方式：二分裂培养：LB液体培养基进行扩大培养分离：LB固体平面培养基划线分离一、实验材料1、大肠杆菌菌种斜面：提供实验用的大肠杆菌。2、LB液体培养基(溶菌肉汤培养基)（1）蛋白胨：（2）酵母提取液：

2、（3）Nacl：（4）水：（琼脂：凝固）生长因子：微生物生长不可缺少的微量有机物提供碳源、氮源、生长因子等。提供生长因子（维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等）维持渗透压良好的溶剂，维持生物大分子结构的稳定。二、实验步骤1、液体培养基灭菌①灭菌对象：②灭菌方法：高压蒸汽灭菌（1Kg/cm2压力、121℃、15—30分钟）（500g/cm2压力、90℃以上、30分钟）若有机物加热会分解灼烧灭菌干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭

3、菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而培养皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。2、分装倒平板①操作环境：超净工作台。②操作前进行消毒：用酒精棉球擦拭桌面和手。③操作:使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。消毒a.煮沸消毒法b.巴氏消毒法（低温消毒法）:如牛奶的消毒c.化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等d.紫外线消毒方法倒平板技术1.培养基灭菌后，需要冷却到

4、50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。5.如何判断培养基是无菌的？将灭

5、菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。灭菌和消毒的比较灭菌消毒概念强烈的理化因素较为温和的理化因素方法灼烧灭菌干热灭菌高压蒸汽灭菌煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂消毒紫外线消毒程度杀死芽孢和孢子不杀死芽孢和孢子芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。3、接种扩大培养接种环灭菌：灼烧灭菌4、划线分离倒置通过接种环在培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。单菌落4、划线分离在数次画线后

6、,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.平板划线的操作方法交叉划线法连续划线法平板划线时不能划破培养基的原因一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。问题讨论1.为什么在操作的第一步灼烧接种环？1.操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？2.以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？3.划线后，线条末端细菌的数目比

7、线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。4.第一次划线后，每次划线之前都要灼烧接种环吗？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感