《补体参与的反应》PPT课件

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1、PartⅠ补体参与的反应PartⅡT细胞数量及其功能检测实验三免疫学教研室王丽娜Email：myx@wfmc.edu.cn补体参与的反应补体的溶血反应----免疫血清的制备与应用㈢补体结合试验T细胞及其功能检测E花环形成试验淋巴细胞转化试验：形态学方法3H—TDR掺入法MTT比色法T细胞亚群检测：间接免疫荧光法免疫组化法------SABC－AP法主要内容补体激活的三条途径经典途径MBL途径旁路途径IC+C1qMBL+病原体配基细菌+C3膜攻击复合物细胞溶解PartⅠ补体参与的反应思考题材料：绵羊红细胞、补体、免疫血清（自制）问题：请设计

2、实验检验你所制备的免疫血清的特异性？1、补体的溶血反应----补体参与的反应原理绵羊红细胞（SRBC）作为抗原与其相应抗体（溶血素）结合后，通过经典途径激活补体，产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生溶血反应。孔号SRBC溶血素补体NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴－6滴33滴－3滴6滴43滴－－9滴结果＋－－－实验步骤及结果判断阴性阴性阳性溶血溶血不溶血反应系统指示系统溶血反应补体结合试验补体2、补体结合试验----补体参与的反应原理12345反应系统Ab＋＋－－－Ag＋－＋－－补体C＋＋＋＋－NS＋＋＋＋＋摇匀，37°C水浴，30mi

3、ns指示系统溶血素＋＋＋＋－SRBC＋＋＋＋＋摇匀，37°C水浴，30mins反应体系与结果判断结果溶血结果否＋是是是－－－－否羊红细胞对照PartⅡT细胞数量及其功能检测1.E花环形成试验原理人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体（E受体），可结合SRBC形成花环样细胞团。因为T细胞的异质性，它们对绵羊红细胞的亲和力不同，所以T细胞可以形成不同类型的E花环，如EtRFC（总花环）、EaRFC（活性花环）、EsRFC（稳定性花环）等。检测T细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况。CD2实验器材肝素抗凝血、

4、绵羊红细胞（SRBC）淋巴细胞分层液、Hank’s液、1640培养液、0.5％戊二醛固定液、灿烂甲酚兰染液试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜等实验步骤⑴密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：取稀释好的人外周血，用滴管贴管壁（倾斜30°）轻轻叠加于2ml分离液上（界面要清晰）配平后2000rpm离心10mins。离心后分为5层，由上8而下分别为：稀释的血浆、单个核细胞、分离液、粒细胞、红细胞。1.淋巴细胞悬液的制备：动作轻柔；分清滴管及枪头！稀释的血液分层液离心前稀释的血浆单个核细胞分层液粒细胞红细胞离心后⑵洗涤细胞：另取一支滴管，

5、仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的单个核细胞，放入盛有5mlHank’s液的试管→→→2000rpm离心5mins。弃上清（倾倒时液体不要回流），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank’s液5ml，重复离心一次。2.弃去上清，留经过洗涤的淋巴细胞悬液0.1ml与绵羊红细胞0.1ml、1640营养液0.1ml混合→→→轻弹混匀后放于37℃温箱15mins。3.取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步非常关键，转速一定要慢）室温静置3-5分钟。4.取出试管，吸去半量上清液，轻轻旋转混匀，沿管壁滴加1滴戊二醛，轻轻混匀静置5mins

6、。5.取25ul液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加盖玻片。6.显微镜下观察。E花环形成实验（灿烂甲酚兰染色，×400）实验结果高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴细胞上结合≥3个SRBC者为E花环阳性。正常参考值：EtRFC：64.4±6.7％；EaRFC：23.6±3.5％；EsRFC：3.3±2.6％实验结果2.淋巴细胞转化试验原理T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，称淋巴细胞转化现象。淋巴细

7、胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。常用方法形态学方法3H-TDR掺入法MTT比色法胞核的大小、与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核仁的有无成熟小淋巴细胞：核染色深、没有核仁，胞浆少、染色为轻度嗜碱性；淋巴母细胞：体积增大，形态不规则，核变大、核质染色疏松，有核仁1-2个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡；其他细胞：中性粒细胞在培养72小时后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。(1)形态学方法----淋巴细胞转化试验镜下结果红细胞未转化淋巴细胞转化的淋巴细胞淋巴细胞转化实验瑞氏染色10×100实验结果淋巴细胞转化率

8、转换的淋巴细胞转换的淋巴细胞＋未转化的淋巴细胞×100％正常参考值：80％3H-TDR掺入法----淋巴细胞转化试验T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培