《色谱柱培训》PPT课件

《《色谱柱培训》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、色谱柱培训前言色谱柱是HPLC分离过程中的核心。一支稳定、高效的色谱柱对建立普适性强、重现性好的方法是必不可少的。不同供应商的色谱柱，甚至来源相同，认为完全一样的色谱柱之间，可能存在很大的差异，尤其是不同色谱柱在塔板数、色谱峰的对称性、保留值、峰间距及使用寿命会有所不同，而这些不同对建立理想的HPLC方法会产生很大的影响培训内容介绍色谱柱担体、固定相以及柱填料信息讨论色谱柱使用过程中的问题及适宜的解决方案同时讨论在常规HPLC分析中，为获得最佳结果，一支“好”色谱柱的重要意义色谱柱的结构色谱柱与柱填料的特性柱填料：大多数使用HPLC分离的色谱柱使用硅胶微粒作为担体。少数为多

2、孔聚合物担体或者其他材料的担体硅胶担体与键合的有机表层应用范围广，重点讨论常见的几种柱填料微粒：实心微球、全多孔微球、灌注微粒实心微球型特点：实心核、起作用的是表面很薄的外壳、微粒的大小通常为1.5~2.5um，快速传质的动力学，对大分子有突出的分离效能；表面积较小，样品容量有限，仅适用于分析型HPLC；峰型尖锐，要求HPLC仪器的柱外峰展因素极小，避免峰展宽灌注色谱柱填料：包含孔径达4000~8000Ả的贯穿孔，贯穿孔中有较小的内联孔（如300~1000Ả）；高流速时，对流与扩散作用共同作用，进入并离开孔结构，减小了峰展宽，柱效与小微粒相当，但压力降却小许多。使用范围：大

3、分子如蛋白质的制备分离，小分子较少插入色谱柱的参数意义：ID&4.6mm颗粒（粒度）的大小在HPLC中极为重要。约5um的微粒直径很好的兼顾了分析柱的柱效、反压和寿命。更小的多孔微粒（如3um）对快速分离很有效。较窄的粒度分布（＜±50%均值）能保证填充柱的稳定、高效和压力降最小硅胶填充微粒物理特性：机械强度很高，可保证填充柱长时间在很高的操作压力下工作，柱效稳定；使柱的反压较低，寿命较长。制作工艺：良好的控制制作工艺，能够得到平均孔径变化范围宽（如8、30、100um）、孔径分布范围较窄和粒度选择较大（如10、5、3um）的填料。能满足大、小分子的分析和制备硅胶担体的表面

4、性质极为理想，其表面可以通过化学改性引入种类繁多、具有不同官能团的键合相硅胶基质填料与水及所有有机溶剂兼容，更换溶剂时，填料大小不会变化（例如溶胀）。这种特性使填充床在用各种类型溶剂时以及使用梯度洗脱期间，仍保持稳定硅胶担体并非完美无缺：在pH8.0以上条件下，硅胶能溶解；硅胶表面显酸性，不适宜于碱性物质的分离插入硅胶溶解曲线硅羟基一般存在三种类型自由或孤立（无氢键键合）的硅羟基一般产生于低浓度中。含自由、酸性硅羟基浓度高的硅胶往往使碱性物质的保留值增加，峰变宽、拖尾。完全羟基化的硅胶基质填料，具有高浓度成对的与缔合的硅羟基，最有利于碱性物质分离。（查成对硅羟基的酸性）硅胶

5、担体的纯度对许多极性化合物的分离极为重要。某些硅胶被一定的金属污染（Al、Fe、Zn、Ni等）这些金属杂质能与螯合溶质络合，引起不对称、拖尾色谱峰，甚至化合物被完全保留，不能洗出硅胶晶格中的其他金属（尤其是铝）能使表面硅胶硅羟基活性增强，酸性增强建议：采用色谱级试剂！！硅胶分类A型硅胶：过去纯度不高的硅胶，适用于分离中性和非电离的化合物B型硅胶：新型高纯度的弱酸性硅胶，一般对离子或可电离的化合物，尤其是碱性物质的分离较好B型硅胶的意义：见FDA批准的化药碱性药物表多孔聚合物填料优点：聚合物微粒有些是疏水性的，可直接用于反相，不需添加表面涂层；在pH1~13均可用；很强的疏水

6、保留性（相对于硅胶基质的C18柱）缺点：柱效低，一般不到类似的硅胶基质色谱柱的一半；在不同有机溶剂中溶胀程度不同。使用范围：非常适用于蛋白样品的分离其他无机填料石墨碳氧化铝色谱柱的结构不锈钢柱管：可用于所有的有机溶剂与大多数水性缓冲液，然而含氯的流动相会缓慢地“卤素腐蚀”不锈钢柱管，尤其是低pH条件下柱管不锈钢成分（铁、镍、铬）牢固络合的样品可能发生这类问题，但因为色谱柱内壁的表面积很小，发生不良反应的机会不大多孔烧结物（滤片）：封闭色谱柱的两端，固体色谱柱的填料一般来说，5um与3um的微粒分别用2um与0.5um孔径的不锈钢滤片发生不良反应的可能比色谱柱内壁大得多峰型不

7、好与样品回收率低可能预示滤片出现问题压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。接头：柱两端连接流动相与柱管的中空环套，由不锈钢制成。用于柱管路联通与柱端高压固定。封头：柱两端的密封螺丝，用于保存色谱柱时封头。柱填料固定相键合硅胶：在硅胶担体表面上共价键有机硅烷或沉积聚合物有机涂层使用最广泛的有机硅烷键填料的表面反应式见下图：结论多官能团键合相与单官能团的键合相相比：多官能团键