白花蛇舌草不同活性成分抗骨肉瘤的实验研究

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1、白花蛇舌草中多糖抑制骨肉瘤的作用机制研究张韬1，陈冬冬2，翁艳2，冯尔宥2，张怡元2*（1.厦门大学附属福州第二医院骨科研究所，2.厦门大学附属福州第二医院，福建福州350007）摘要：为探讨白花蛇舌草活性成分对骨肉瘤的作用及其机制，从白花蛇舌草中分别提取黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类，MTT检测不同提取物对MG-63细胞活性的影响，同时建立裸鼠骨肉瘤移植瘤模型，观察不同提取物对移植瘤的生长抑制作用。并通过流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化，westernblot检测Bax及Bcl-2蛋白表达

2、水平。结果显示四种提取物都对MG-63细胞的增殖具有明显抑制作用，呈现明显的剂量依赖性，最优药物浓度为80μg/ml。在最优药物浓度下四种提取物对裸鼠移植骨肉瘤也具有抑制作用。其中多糖类对MG-63细胞活性和移植瘤的抑制作用都最强，明显促进了MG-63细胞凋亡，阻滞了细胞周期。Bax表达量在48h内随着白花蛇舌草多糖类提取物作用时间延长而增加，而Bcl-2表达量在48h内随着白花蛇舌草多糖类提取物作用时间延长而降低。由上述结果可知，白花蛇舌草活性成分中多糖类的抗肿瘤活性最强，其作用机制可能是通过

3、抑制骨肉瘤细胞增殖、促进细胞凋亡和阻滞细胞周期来达到抑瘤作用。关键词：白花蛇舌草；骨肉瘤；凋亡中图分类号：R965.1文献标志码：A骨肉瘤是青少年最常见的原发恶性骨肿瘤，肿瘤恶性程度高，预后差，给家庭和社会带来极大负担。目前，手术是骨肉瘤最有效的治疗方法，但肉瘤位置特殊、术后转移和经济等均是影响患者治疗的因素，因此寻找其他经济、安全的保肢治疗方案尤为重要。白花蛇舌草（Hedyotisdiffusa，HD）属茜草科耳草属植物，清热解毒、消痛散结、利尿消肿、抗菌消炎、免疫调节及抗癌的功效，是中药用于

4、治疗肺癌、胃癌、肠癌、乳腺癌、宫颈癌、淋巴瘤等癌症复方中常用的单味药[1,2]，但其在骨肉瘤中的抗肿瘤作用鲜有报道。研究发现，HD水提取物、乙酸乙酯萃取物、醇提取物都具有抗肿瘤作用，其有效成分有黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类等[3]。本研究首先通过体外实验筛选HD有效成分中抑制骨肉瘤细胞株MG-63增殖最明显的成分，然后通过建立裸鼠移植瘤模型，观察HD有效成分对移植瘤增殖、骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，并初步探讨其作用机制。1材料与方法1.1材料人骨肉瘤MG-63细胞株（南

5、京科佰生物），BALB/C裸鼠（体重18±2g，吴氏实验动物中心），白花蛇舌草提取物黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类（福州大学中药研究所馈赠），胎牛血清(Hyclone公司)，DMEM培养基(Hyclone公司)，MTT（Sigma），RIPA裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒和UltraECL底物化学发光检测试剂盒（Invitrogen，美国），鼠抗人Bcl-2、Bax、内参GAPDH，羊抗鼠HRP标记二抗（Abcam，英国）；Annexin-FITC-PI凋亡检测试剂盒（凯基生物）。1.2细胞

6、培养将MG-63细胞接种于细胞培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每48h传代1次，取对数生长期的细胞用于后续实验。1.3MTT法细胞生长至对数期后胰酶消化，培养基重悬，96孔板中每孔加入200μL细胞悬液（5×103个细胞/孔）。加入20μLHD提取物（黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类），终浓度均为10、20、40、80、160μg/mL，生理盐水作为阴性对照，相同终浓度顺铂作为阳性对照，每组重复6孔。培养约24h，待细胞贴壁后，弃培养基，每孔

7、加入20μLMTT（终浓度为5mg/mL），继续培养4h，弃上清，每孔加入160μLDMSO，振荡10min，待结晶紫完全溶解后，酶标仪测定492nm下吸光值（A），计算细胞生存率，生存率=（实验组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%。1.4骨肉瘤裸鼠模型的建立MG-63培养至对数期后，调整细胞浓度至5×107/mL细胞悬液。充分麻醉裸鼠后，无菌操作台上在裸鼠右后肢胫骨上端行10mm纵切口，剪开皮肤，暴露胫骨上端。用1mL注射器缓慢钻入胫骨结节和胫骨内侧髁之间的骨皮质，穿透后

8、拔出。用微量注射器向胫骨髓腔中注入0.2mL准备好的细胞悬液（约1×107个瘤细胞），边注射边会抽针头，注射完后用5-0#缝线关闭切口。术后SPF级独立送回风净化笼中饲料并观察成瘤情况。1.5动物分组及给药荷瘤裸鼠随机分为5组，即对照组：隔日给予同等剂量生理盐水灌胃；黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类组[3]，采用隔日灌胃给药，给药剂量为50mg/kg。20d后处死裸鼠，剥离移植瘤，称重，取平均值。1.6流式细胞仪检测细胞凋亡及周期MG-63细胞培养至对数期后调整细胞密度为1×106接种于细胞培