《离子交换法》PPT课件

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1、3.3離子交換法3.3.1原理概述：離子與固相擔体帶電基團間的爭奪戰3.2.2交換介質：是帶有電荷基團的長鏈大分子聚合物3.3.3緩衝液與層析系統：緩衝液的影響極大3.3.4管柱操作方法：如何操作一隻離子交換管柱3.3.5色層焦集法：依蛋白質等電點不同來進行分離■陰離子交換法AnionExchange：擔体++++++++++++++++樣本分子流動相固定相陽離子基團Counterion陰離子+■質子可以吸著或脫離一基團：Proton：最小且最多的生物粒子，影響酸鹼度及分子帶電性質H+lonepairelectronsHHH+NHHN胺基H+羧基COOHCOO■

2、選擇離子交換介質：+NetChargeofaProteinBufferpHpI-3456789100陰離子交換陽離子交換■陰離子交換膠體的pH變化：擔体OH-OH-pI=6pH=5pH=7-+DonnanEffectOH-OH-+++++■離子取代優先順序PeckingOrder：++++++++++++++++++>>電荷高者離子大者濃度大者>■陰離子交換法的分離範圍：10050257564kDpHMonobead■各種離子交換介質：StrongWeakWeakStrongResin/PolystyreneGlycan/Cellulose=XAnionExch

3、angerCationExchangerIRC-150Dowex-50Dowex-1Dowex-2Dowex-3IR-45-NHR2+--SO3-NR3+-COO-X=Sephadex,Sepharose,SephacelorcelluloseCM-XDEAE-XTEAE-X(QAE-X)Phospho-X陰陽強弱分類SQ-OCHCHNHR222+-NR3+42--PO2--OCHCOO■膠體的組成與外型：CelluloseSephcelMonobeadPharmacia(1980)SeparationNews:5●膠體外型影響流速與解析力Pharmacia(1

4、991)IonExchangeChromatography–PrinciplesandMethodsp.24■不同膠體的吸著容量有很大差異：DEAE-SephadexA-25DEAE-SephadexA-50DEAE-SepharoseCL-6BDEAE-SephacelLactalbuminAlbuminFerritin1911045383110211586214.38.6Buffer:0.01MTris-HCl,pH8.0mg/mLgelAdaptedfromPharmacia(1991)IonExchangeChromatography–Principle

5、sandMethodsp.64■離子交換法預備試驗：5.05.56.06.57.07.58.08.59.09.50.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50102030405060708090100pHNaClpH=70.15MNaClmg/mLprotein7.00.1550Enzyme+Buffer+GelSupSpin-downIncubationSpinSup+SpindownAdaptedfromPharmacia(1991)IonExchangeChromatography–PrinciplesandMethods

6、p.70Capacity■膠柱的裝填方法：緩衝液平衡溫度平衡靜置膠體清洗膠體預估體積裝填膠體暫停流洗X繼續流洗加上reservoir已堆積沈積中上清加壓流洗加上adaptor緊密堆積檢查好管柱是否暢通12GelGel■液相層析管柱系統：緩衝液梯度製造器幫浦記錄器監視器管柱膠體膠體裝填分劃收集器(1)(2)(3)(4)(5)adapterreservoir轉接器■拉鹽梯度的兩種方式：連續梯度階段梯度高限溶液低限溶液兩種方式均可，各有特點。減少無效空間Pharmacia連續梯度連續梯度階段梯度Deadvolume膠柱面■連續與階段梯度比較：0.10.20.30.40

7、.10.20.30.4050100150200050100150200Elutionvolume連續梯度階段梯度蛋白質濃度AdaptedfromPharmacia:IonExchangeChromatography–PrinciplesandMethods■鹽濃度溶離條件比較：0204060801000204060801000.10.20.30.40.10.20.3蛋白質濃度ElutionvolumeAdaptedfromPharmacia:IonExchangeChromatography–PrinciplesandMethodsNaCl■溶離體積會影響解析度

8、：0.5M0.5M0.5