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1、第二章基因工程的基本条件一、用于核酸操作的工具酶二、基因克隆载体三、目的基因的获得四、基因工程受体菌或细胞三、目的基因的获得限制酶酶切直接分离法PCR扩增法从mRNA合成cDNA化学合成法通过构建基因文库分离法对已克隆在载体中的目的基因，可根据目的基因两侧的限制酶识别序列，选择适当的限制酶酶切，获得目的基因。（一）限制酶酶切直接分离法注意：目的基因内部不能有该限制酶的切点，否则目的基因会被切成碎片！Ampr5’AOX1HIS4Kanr3’AOX1ColE1pPIC9K/hVEGF165EcoRINotIBglIIhVEGF165Bgl
2、II9.8KbTTSAmpr5’AOX1HIS4Kanr3’AOX1ColE1pPIC9K9.3KbBglIIBglIISnaBIEcoRIAvrIINotISTTf1oriAmprlacZpGEM-T/hVEGF165hVEGF1653.5Kb（二）PCR法扩增目的基因利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。PCR(polymerasechainreaction)：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链。双链DNA解链为单链DNA；引物与模板单链DNA的特定互补部
3、位配对、结合；退火：变性：延伸：变性退火延伸30thcycle？由于每一循环所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增加，即Y=2n(n为循环次数)。230(109)copiesPCR技术的发明--DNA操作技术的革命发明人：美国生化学家KaryB.MullisTheNobelPrizeinChemistry1993MullisKB.Theunusualoriginofthepolymerasechainreaction.ScientificAmerican.1990,262(4):56-61,64-5.19
4、90.04MullisKB.Dancingnakedinthemindfields.1998.041983.03开汽车时的联想：蜿蜒崎岖的山路--DNA双螺旋行驶的汽车--一小段DNA引物1972在加州大学伯克利分校获得博士学位1979进入私人生物技术公司Cetus1983.08正式做有关PCR原理的报告1983.09Mullis开始动手做实验1984.11首次取得可信结果1985.01RandallSaiki加入，结果毋庸置疑1985.03Cetus公司申请专利1985.12SaikiRK,ScharfSJ,FaloonaFA,Mu
5、llisKB,HornGT,ErlichHA,ArnheimN.Enzymaticamplificationofbeta-globingenomicsequencesandrestrictionsiteanalysisfordiagnosisofsicklecellanemia.Science.1985,230(4732):1350-4.1986.05冷泉港“人类分子生物学”专题研讨会1987.01MullisKB,FaloonaFA.SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerasecatalyz
6、edchainreaction.MethodsinEnzymology.1987,155:335-50.1991.12Cetus以$3亿将专利卖给Hoffmann-LaRoche公司1986.06Saiki等将耐热DNA聚合酶--Taq酶引入PCR技术。SaikiRK,GelfandDH,StoffelS,ScharfSJ,HiguchiR,HornGT,MullisKB,ErlichHA.Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.
7、Science.1988,239(4839):487-91.1988.011989Science杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。1986.09Mullis离开Cetus公司EppendorfBio-radABIPCR法扩增目的基因的前提：已知目的基因全序列或其两侧序列，化学合成与模板互补的上、下游引物。Taq酶无3’→5’外切酶活性，无阅读校正功能，在扩增过程中会引起错配，30次循环Taq酶错配率约0.25％。措施：问题：可能造成目的基因碱基序列的改变。原因：选择高保真Taq酶，如Pfu。因Taq
8、酶对dATP具有优先聚合活性。5’AAPCR扩增产物5’由Taq酶扩增的PCR产物，3’末端总是带有一个非模板依赖型的突出碱基，而这个碱基几乎总是A，T载体TT5’5’T7lacZMCSoriAmpr可用T载体克隆。（三
