张易祥微生物遗传学实验

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1、实验八微生物遗传实验----抗药性突变株的分离一实验目的掌握微生物变异的原理了解紫外线诱变筛选突变菌株的方法学习用梯度平板法分离抗药性突变株二实验原理基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用。1、自发突变---（抗药性突变）1）基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞的遗传变异。这种变异有时能使细胞在有害的环境中存活下来，抗药性突变就是一个例子。2）微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株

2、的一种手段，而不是引发突变的诱导物。3）因而在含有一定抑制生长药物浓度的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变的细胞会在平板上生成菌落。4）将这些菌落挑取纯化，进一步进行抗性试验，就可以得到所需要的抗药性菌株。5）抗药性突变常用作遗传标记，因而掌握分离抗药性突变株的方法是非常重要的。6）为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法。本实验用梯度平板法分离大肠杆菌抗氨苄青霉素突变株。2、紫外线诱发突变紫外线是一种常用的物理诱变因素，主要作用于DNA，引起DNA损伤；为避免光修复，处理后

3、的微生物应放暗处培养。三实验步骤1、抗药性菌株的筛选(p.167)（1）取一个已经灭菌的空大平皿，把培养皿斜放(一边垫起)，在无菌条件下倒入不含药物的底层培养基（10mLLB培养基,已分装好，保温在灭菌锅中，要快）；(在超净工作台做)（2）待平板中的培养基凝固后将平皿放平，再倒入含有链霉素的上层培养基10mL（含有链霉素200u/mL：现配现用，原液20万单位，吸50微升加入50ML培养基）；2个组做，8个组用。(在超净工作台做)在皿底用箭头标记,示药物浓度从低到高。注意：抗生素要在培养基冷却到50

4、度左右再加；（3）取一支大肠杆菌液体培养物，用移液枪移取200微升菌液到梯度平板上，进行涂布。（实验室做）（4）将平板倒置于37℃培养2天；观察经一次培养的梯度平板上大肠杆菌的生长情况。后续实验（不做）（5）选择平板上1～2个生长在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环接触单个菌落朝高药物浓度的方向划线。（6）将平板倒置于37℃培养2天；观察经二次培养的梯度平板上大肠杆菌的生长情况。2、紫外线诱变枯草杆菌（在实验室做）1）取菌悬液5ml，放入无菌空平皿（大平皿），去盖置于紫外灯下照射3min（15W,

5、距离30cm）；2个组做，8个组用。2）稀释：用10倍稀释法把经过照射的菌悬液在无菌水中（已分装好，每试管9mL）稀释成10-1---10-6。同样将未处理的菌液进行同样稀释做对照；3）分别取10-4，10-5，10-6稀释菌液150微升各涂一个小平板(3个对照，3个实验)；需用淀粉培养基4）培养：将上述平板用黑纸包好，置37℃培养48h。5）观察诱变效应选取菌落较少的平板，加几滴碘液，观察透明圈大小，同时与对照平板比较。思考题：1、梯度平板中部的单个菌落被划线，并二次培养的目的是什么？2、如果要计

6、算紫外线诱变的致死率，该如何设计实验？