工业发酵菌种选育1

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1、工业发酵菌种选育诱变育种以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。适于改良品种的个别性状育种程序简单，年限短变异的方向和性质不定与其它育种方法结合使用，将发挥巨大作用提高突变率，扩大“变异谱”、创造新类型诱变育种的意义及特点概念以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从变异体中找出产量高、性状优良的突变株，并找出其最佳培养基和最佳培养条件，使其在最适的

2、环境条见下合成有效产物。诱变育种步骤★出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选(一)出发菌株的选择1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。(二)处理菌悬液的制备诱变育种要求所处理的细胞必须是对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。为什么不选择多细胞的菌悬液？为什么选择对数生长期的菌？(三)诱变处理根据后面有关诱变剂及诱变处理的

3、介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。(四)中间培养由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。(五)分离和筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异。（二）诱变育种应注意的问题诱变成功的关键：出发菌株的选择诱变因素的选择诱变剂量的选择单孢子（或单细胞）悬液的制

4、备出发菌株的选择1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3．已经诱变过的菌株，再诱变易产生负突变，再度提高产量比较困难，但也有可能会发生正的突变。诱变因素的选择诱变处理方法：物理诱变剂和化学诱变剂主要的诱变剂：紫外线、硫酸二乙酯和亚硝基甲醛尿等。诱变方法：单一诱变剂处理复合诱变剂处理物理诱变剂：射线如紫外线、X-射线、γ-射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于

5、一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。化学诱变剂：碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱

6、变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。不同的菌株选用不同的诱变剂！野生型菌株(遗传性不稳定):用缓和的诱变剂。遗传性稳定的菌株:先要用强烈的不常用的诱变谱广的诱变剂处理，使其发生强烈的变异，然后再用缓和的诱变剂进行处理或多次自然分离。单孢子悬液的制备细胞的要求：处于对数生长期，并且是均匀状态的单细胞悬液。获得单细胞悬液的方法必须要有针对性。例如：诱变霉菌或放线菌时，应处理它们的孢子；诱变芽孢杆菌时，应处理它们的芽孢。（三）常用的物理诱变剂处理方法紫外线

7、诱变紫外线的主要作用光复活作用光谱范围与有效光谱范围40-390nm200-300nm；260nm如何避免光复活作用？紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外

8、线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。(二)操作步骤1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。2．将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。