《核酸的研究方法》PPT课件

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1、核酸的研究方法核酸的分离、提纯和定量测定核酸的超速离心核酸的凝胶电泳核酸的核苷酸序列测定DNA聚合酶链式反应（PCR）DNA的化学合成制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分离、提纯和定量测定真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/LNaCl），据此，细胞破碎后采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。DNA

2、沉淀：0.3MNaAC-70%乙醇（一）DNA分离纯化也可用SDS破碎细胞，蛋白酶K降解蛋白后，苯酚抽提，再用RNase分解除去RNA而获得纯化的DNA。制备RNA时，最重要的是使RNase灭活：①容器用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。然后经过高温处理。DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性；②加入强变性剂（如胍盐：可使所有蛋白质变性）使RNase失活；③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin)（二）RNA的分离①用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋

3、白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白②用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提：异硫氰酸胍是极强的蛋白质变性剂。后用苯酚和氯仿多次除净蛋白质③用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心，蛋白质在最上面，DNA在中间，RNA沉在底部★mRNA的制备：oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法制备RNA的方法：（三）核酸含量的测定2、定糖法RNA：核糖→糠醛→→绿色物质（670-680nm）DNA：脱氧核糖+二苯胺→兰色物质（595-620nm）苔黑酚/地衣酚浓HCl浓硫酸1、紫外吸收法1个A～50μg/ml双链DNA～

4、40μg/mlRNA或单链DNA3、定磷法核酸含磷量为9.5%1g磷相当于10.5g核酸4、琼脂糖凝胶电泳溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光荧光强度与DNA含量成正比细胞或组织中核酸含量测定方法生物组织酸溶性物质残留物冷的稀酸抽提脂类物质残留物热酸法冷酸法碱法残留物酸抽提液(RNA+DNA)热酸提取残留物残留物酸抽提液(DNA)热酸提取酸抽提液(RNA)冷酸提取酸抽提液(RNA)残留物(DNA)有机溶剂抽提碱降解再酸化纯DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染纯RNA

5、比值2.0，<2.0DNA、Pr、苯酚污染（四）、核酸纯度的测定OD260／OD280二、核酸的沉降特性与超速离心利用超离心技术，可以测定核酸的沉降常数和相对分子质量。密度梯度沉降平衡超离心法在核酸分子构象的研究中应用颇广。DNA分析时，常用氯化铯密度梯度。主要应用于以下方面：核酸密度的测定测定DNA中的G-C含量溶液中核酸构象的研究用于核酸的制备8MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10

6、-10ρ：未知DNA的密度ρ0：为标准DNA的密度ω：角速度（弧度/秒）r：样品到转轴的距离r0：已知DNA到转轴的距离（一）核酸密度的测定G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系，因此可用能用该方法计算DNA碱基成分，计算公式为：ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10需注意的是：含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值，不能用该公式计算。（二）测定DNA的G-C含量RNA＞DNA变性DNA＞双链DNA＞蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的构象（

7、四）用于核酸的制备不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来，利用EB（溴化乙锭）与核酸结合，能在紫外灯下发出荧光的特性，将目的区带收集。是当前核酸研究中最常用的方法。有许多的优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。三、核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分离范围广。电泳迁移率决定于：（1）核酸分子的大小（迁移率与相对分子质量对数成反比）（2）胶浓度（迁移率与

8、胶浓度成反比，常用0.7～1%）（3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子（4）电压（一般5V/cm,电压与迁移率成正比)（5）碱基组成（影响不大）（6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）琼脂糖凝胶电泳常用于DNA分析；分析RNA时需加入蛋白质变性剂甲醛。电泳完毕用溴化乙锭（0.5μg/mL）染色，用紫外光检测★琼脂糖电泳用于DNA分子量的测定在同一凝胶中加入已知相对分子质量的样品（分子marker)，在