《朱记平开题报告》PPT课件

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1、RAS对禽流感病毒增殖的影响及流感病毒NS1基因eIF4GI结合区缺失株对病毒增殖及细胞因子影响的研究专业：预防兽医研究生：朱记平导师：金梅林教授开题报告RAS蛋白对禽流感病毒在细胞内增殖的影响一、研究背景二、研究目的三、研究内容四、技术路线五、工作进展一、研究背景（一）RAS家族（二）RAS与病毒的潜在关系（一）RAS家族RAS家族属于常见的癌基因家族种的一类，在正常细胞中以非激活形式存在，故又称为原癌基因。主要特点可概括如下：（1）在进化进程中，基因序列呈高度保守性。（2）它的作用是通过其表达产物蛋白质来体现的；它们的存

2、在对正常细胞不仅无害，而且对维持正常生理功能、调控细胞生长和分化起重要作用，是细胞发育、组织再生、创伤愈合等所必需。（3）在某些因素（如放射线、某些化学物质等）作用下，一旦被激活，发生数量上或结构上的变化时，就会形成癌性的细胞转化基因。ras家族主要包括Hras,Kras,Nras家族成员基因序列差异大，但所编码的蛋白质是P21，位于细胞质膜内面，P21可与GTP结合，有GTP酶活性，并参与cAMP水平的调节。Ras蛋白的结晶结构如图所示，当GTP水解时，Ras蛋白的构象会发生改变，此改变涉及L4，它含有第61位点，致癌突变

3、有时在此处发生。Ras的组成型激活的突变发生在L1的第12位点。它直接影响到和GTP的结合。在野生型和癌变型之间的变化限制在这些区域中，并使Ras产生一种构象来承担GTP的水解，这是癌致性的基础，关键是GTP水解能力。图Ras蛋白的晶体结构含有6个β链，4个α螺旋和9个连接环。GTP被L9,L7和L1所包被。从30到40的的效应区是相对暴露的，而其他的区域也有暴露的（引自Lewin,2000）（二）RAS与病毒的潜在关系1、Activated(oncogenic)rasinducesacellularinhibitorofP

4、KR.(Mundschauandet.）Activatedrasisfoundin30%ofallmalignanthumantumors2、TheactivatedformofPKRiscapableofblockingproteinsynthesisthroughitsabilitytohosphorylatethesubunitofeukaryotictranslationfactor2.Thismechanisminhibitsviralreplication.《AGeneticallyEngineeredInflu

5、enzaAViruswithras-DependentOncolyticProperties》《Ras-dependentOncolysiswithanAdenovirusVAIMutant》《Reovirusoncolysis:TheRasRalGEFp38pathwaydictateshostcellpermissivenesstoreovirusinfection》《ActivatedN-RasContributestotheChemoresistanceofHumanMelanomainSevereCombinedI

6、mmunodeficiency(SCifi)MicebyBlockingApoptosis‘》二、研究目的通过研究NRAS蛋白在细胞内的高表达是否有助于禽流感病毒的增殖，进而分析禽流感病毒与RAS蛋白之间的相互关系，并推断禽流感病毒与细胞癌症转化的相互关系。三、研究内容（一）突变N-RAS基因，获得N-RAS高表达细胞系，并进行检测（二）病毒感染的观察以及病毒输出量测定，PKR活化的测定（三）研究IFN与RAS的关系（一）突变N-RAS基因，获得N-RAS高表达细胞系，并进行检测1、根据Genebank登陆的人NRAS序列，

7、设计NRAS基因开放阅读框（570bp）上下游引物，从细胞内扩增NRAS开放阅读框基因，定点突变NRAS12位氨基酸密码子和61位氨基酸密码子，并连接到真核表达载体pCDNA3.1+上（1）突变12位密码子，GGTTGT（2）突变61位密码子，CAAAAA2、脂质体转染法将pCDNA3.1-NRAS质粒转染到VERO细胞内，使用NRAS多克隆抗体，Westernblot分析NRAS蛋白表达情况。点突变（1）突变12位密码子，GGTTGT5’AGCATGTGGTGTTGGGAAAAGC3’5’CACATGCTCCAACCACC

8、ACCAGT3’（2）突变61位密码子，CAAAAA5’GGAAAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGAG3’5’TTCTTTTCCAGCTGTATCCAGTATGTCC3’真核表达引物，连在pCDNA3.1+上5’GCGGTACCGAAATGACTGAGTACAAACT3’(kpn