chip protocol中文

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1、CHIPPROTOCOL（基于milliporeEZ-CHIPcatalog#17-371）：实验原理：在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。实验步骤：第一天：【实验材料准备】：1000ul、100ul、200ul、20ul移液器，大、中、小号tip，1.5mlEP管，200ulPCR管。【实验仪器准备】：台式低温离心机，超声仪，电泳设备一套，

2、旋转混匀仪，层析柜。【实验试剂准备】：SDSlysisbuffer复温，使其充分溶解，避免沉淀；proteaseinhibitorcocktail室温下充分解冻；PBS预冷（若使用试剂盒提供10xPBS，使用前还需用去离子水稀释成1xPBS工作液）。（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎*。1、收集细胞（1-2x10^7），加入37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（0.7%）。2、室温孵育10min（精确计时）。3、及时终止交联：加10x甘氨酸终浓度为1x。混匀后，在室温下放置5min。4、沉淀细胞（700g4℃2-5min），用冰

3、冷的PBS清洗细胞2次。5、弃上清（细胞沉淀可以暂时冻存于-80℃备用）。6.准备裂解液（1mlSDSlysisbuffer+5ulproteaseinhibitorcocktail）；按照细胞量（1x10^7hela细胞对应1mlSDSlysisbuffer）加入SDSLysisBuffer，重悬细胞。分装成300-400ul1管（裂解产物可以-80℃冻存备用）。7、超声破碎（根据具体情况调整）：普通超声仪：3档冲击15s冰上放置45s共5次Bioruptor超声神器：中档冲击15s停顿45s≧14次（更均一更集中）8、琼

4、脂糖凝胶电泳鉴定：取1x10^5个细胞，加入CHIPdilutionbuffer至终体积50ul，进行解交联后电泳Option1—a.加入RNaseA（10mg/ml）1ul，37℃孵育30分钟。b.加入蛋白酶K1ul，62℃孵育2小时。c.取上清跑胶（2%琼脂糖凝胶电压130V时间20min），smear条带集中在200-1000bp即可，500左右为佳。Option2—a.加入蛋白酶K1ul，62℃孵育2小时。b.每50ul样本加入0.25ml结合试剂A（5倍体积），充分混匀。c.将上述混合液转移至吸附柱中，吸附柱放在收

5、集管内。d.10000~15000g离心30秒，去下清。e．向吸附柱内加入洗涤液B500ul，10000~15000g离心30s，去下清。f.空离30s，10000~15000g。g.将吸附柱转移至新的EP管，向吸附柱中心滴加50ul洗脱液C，10000~15000g离心30s，洗脱液即为纯化回收的DNA。h.取上清跑胶（2%琼脂糖凝胶电压130V时间20min），smear条带集中在200-1000bp即可，500左右为佳。9、离心去除不溶物质（10000~15000g4℃10min），收集上清，分装至100ul1管，-8

6、0℃可保存2个月。【实验补充及注意事项】：1、不是所有CHIP都需甲醛固定。做甲醛固定的为X-ChIP，而不需要固定的为N-ChIP。nativeChIP主要用于组蛋白修饰、核小体定位的研究,由于组蛋白与DNA之间的作用力较强，因此N-CHIP不需要采用甲醛固定，而是让DNA结合蛋白与DNA之间保持一种自然状态，采用微球菌核酸酶对染色质进行消化，比如：HistoneH3andHistoneH4都不需要交联反应,因为它们本身来说和DNA结合的非常紧密.组蛋白H2A和H2B并不是紧密联接,但是在nativeChIP中依然可以不需

7、要交联反应.X-CHIP适用于结合力较弱的DNA-蛋白质相互作用的研究。2、当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。例如细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。甲醛的交联反应是完全可逆的，交联的进程可被加入的甘氨酸终止。3、交联时间需要预实验来确定。交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失，另外基因组上结合了太多的蛋白，也

8、会增加背景；交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。4、超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。使用普通超声仪时超声探头要尽量深入管中，但不接触管底