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1、中国细胞生物学学报,一利用人工实现基因沉默陈起振张志仙曹家树浙江大学蔬菜研究所,杭州摘要是一组长度约为的非编码蛋白质的短序列,能通过碱基互补配对的方式指导降解靶基因或抑制靶基因的翻译。的主要功能是调控基因的表达,在生物体的生长、发育及疾病发生中扮演着重要的角色。本文介绍了利用实现基因沉默的作用原理,人工合成,构建转基因载体,实现对目的基因的沉默及这种工具在生命科学领域的应用前景。关键词人工二基因沉默是一类由内源基因编码的长度约这是抑制基因表达的默认机制,但是为的非编码单链分子,它们在动植物中具体是阻碍翻译起始,还是阻碍翻译的延伸参与转录后基因表达的调控。最早被确
2、认的还存在争议。由于和靶基因之间是在线虫中首次发现的一和'一,,随不用完全匹配就可以实现调控,所以一个后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种可以有多个靶基因,几个也可以共同调控生物物种中鉴别出数百个。一个基因。大部分动物是通过抑制靶基能够降解靶基因或抑制靶基因的翻译,从而因翻译进行调控的,与此同时会由于脱腺普调控基因的表达,所以在真核生物中,也化、去帽作用和外显子溶解消化等而降解,但这种能引起干扰现象。近年来利用人工现象并不是由蛋白引起的切割造成的,并且有胭,的技术,实证据证明的降解和翻译的抑制是两条独立的现特定基因的沉默,特别是用于共同抑制几个相关调控途径
3、。基因,这种包含一个发卡结构前体的载体也被称作而的原理就是将一的第二代载体。这种技术以其特异性、高效和与互补配对的序列置换为设计性受到了研究人员的关注,在动植物抵抗外源病毒、好的序列后转入动植物中,利用的作用机生长发育调控方面起着重要的作用,而且在功能基制来抑制特定靶基因的功能,。因组研究、基因治疗方面有着广泛的应用前景。的设计和载体构建的作用原理最初是在人类细胞系中应用的“,随利用的是抑制基因表达的后又用于拟南芥中川。这些研究结果显示都能有效原理,成熟的形成后,整合到介抑制靶基因的表达,而且无论是组成型表达导的沉默复合体一还是特异型表达都能很好起到应有的作用,
4、组成型,租中,然后与靶基因结合,能够与靶表达的效果和内源一样都具有高度的特基因完全互补或不完全互补的可异性,,'。能会导致靶基因的特异性剪切,中的用该方法抑制目的基因的表达,首先要设计蛋白能直接切开与互补的靶针对于目的基因的,设计的在第一中的磷酸二酷键,形成小片段并直接降解。另外一种情况是,与目的基因之间匹配程收稿日期一一接受日期一一国家自然科学基金资助项目度较低的时候会抑制翻译,在植物和动物中通讯作者。一,一乃￡434·综述·个碱基位置为尿嗜睫,在第十个碱基的位置是腺嘿吟,因为内源中大都是这样,更利于的抑制效率。用于植物的可以用助来设计,只需要将目的基因的序列
5、输入,就能够得到相应的候选,目前已经有多种植物可以通过这个网站来设计罗笔。动一一物方面设计通常是通过一书一完成的。图的合成根据文献,做适当修改之后要选择合适的骨干,也就是合适的前体印一。用于构建载体的一洲要符合以下几点首先这个前体的序列不要太长预测的二级结构能形成一个短而简单的发卡结构和能够完全互补,而术将改造成和没有插入或缺失前体序列应在数据库中存在,两个载体,这两个载体都由月性尸夕一万组成或有和它相关的文献研究网。现有的研究用过很多型串联启动子启动。等艺设计了两种载前体,拟南芥前体经过修改后已经体和,分别包含了一和成功地沉默了拟南芥、番茄、烟草中的基因,,,
6、',,,。一,可以直接将设计好的替换到但是,现在还没有研究表明拟南芥中的前体在所有这两个载体里面,己有的研究也证明这两个载体植物中都能起作用,所以也许用自身内源的高效,'。动物方面用过的载体有一前体作为骨干会更好,特别是那些高效的,,,,,、的前体。水稻中的一已经用于水稻·一一,`一,`,,、的构建”,莱茵衣藻柳中,,、,,、,,。虽然这些载的前体一和。一也成功用于该物体有所差别,但是都含有较强的启动子,并且有种'卜,“。'一、,一也在人类和动物石片等可以方便检测表达的标记基因。等洲细胞中得到了应用。研究了哺乳动物细胞中不同载体的表达效但是选择了合适的后,必须将
7、其连接果,结果显示个载体中有个表达效果明显,另外,到一个前体上,这一步通常用几次来多表达载体中的数量最好不要超替代内源的序列,如图所示,引物一用过个,而在多表达载体中的相对来替换和蓝色部分,引物和是位置,并不会明显影响其干扰活动。前体上的序列,首先分别以一、一、一为引物扩增,然后以它们的产物为模板,和为引转基因植株的检测和抑制效率物扩增,即可得到包含的前体。等四改对于转基因动植物,通常要检测的表进了这项技术,可以用两对引物通过一次克隆达效果和对目的基因的抑制效率,一般用杂。交检测的表达,靶基因的表达量可以用构建高效的载体是比较简单易行的。来检测,同时可以用引物,
8、用改进的研究表明,在组成
