《放射免疫技术》PPT课件

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1、第七章放射免疫技术第一节　放射免疫技术一、原理及分类二、常用的放射性核素三、标记物制备及鉴定四、抗血清鉴定第二节　放射免疫分析一、基本原理二、实验方法及测定第三节免疫放射分析一、基本原理二、IRMA与RIA的比较思考题小结免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。标记免疫分析：用可微量或超微量检测的示踪剂标记抗原、抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。标记免疫技术－基本概念常见标记免疫技术放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术第一

2、节放射免疫技术早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。放射免疫RIA以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。免疫放射IRMA以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体

3、分离游离和结合标记抗体。放射受体分析RRA放射配体结合分析RBA其它一、放射免疫技术－原理及分类二、放射免疫技术－常用的放射性核素125I3H射线γβ理化性活泼差核素丰度>90%－半衰期60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂常用标记核素125碘-标记物的制备－标记125I-化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子，通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。125I或125I+125I-标记物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反应直

4、接标记法三、放射免疫技术－标记物制备及鉴定使用无还原剂的高比放射性碘源被标记物用量要少ch-T用量要低控制总反应体积<200μl反应时间1-2分钟弱碱性反应条件间接标记法联接标记(bolton-Hunter)预先将125I用ch-T法标记琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。bolton-Hunter125碘-标记物的制备－纯化凝胶过滤法离子交换层析法聚丙烯酰胺凝胶电泳高效液相色谱法聚合、损伤物标记蛋白游离125I125碘-标记物的制备－鉴定标记物质量

5、高比放射性高纯度完整免疫活性放射化学纯度单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率应大于95%免疫活性标记物与抗体结合的能力标记物与过量抗体反应百分比该值越大,标记物免疫活性好比放射单位化学量标记物中所含的放射性强度单位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性过高，将影响标记物免疫活性计算法：依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性.自身置换法：比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性结果准，测定复杂比放射性－计算法结果欠准，计算简便自身置换曲线反应系

6、统：限量Ab和递增剂量(cpm)的标记抗原标记抗原的结合率(B/T%)随标记抗原总量的增加而减少两条曲线平行,若标记抗原与标准品抗原具有相同的免疫活性标准曲线反应系统:抗体（限量）、标记抗原（定量）和剂量递增的标准抗原组成标记抗原与抗体的结合率(B/T%)随标准抗原的增加而竞争抑制性减少比放射性－自身置换法标准曲线与自身置换曲线平行表明在相同的放射性结合水平上，二实验中抗体上结合的抗原物质总量相同计算置换曲线平行段某结合率的放射性强度(cpm/ml换算为nCi/ml)计算标准曲线平行段相应结合率对应的标准

7、抗原化学量(ng/ml)以平行段多点结合率对应的放射强度和标准抗原量进行直线回归，其斜率即为比放射性(nCi/ng)四、放射免疫技术－抗血清鉴定抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合强度用亲和常数Ka表示。单位为稀度单位（LM-1）Ka值高（109～12L/mol）有助于提高灵敏度、精确度和准确度亲和性亲合力高亲合力低放射免疫技术－抗血清鉴定特异性:指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力交叉反应率：将反应的最大结合率抑制下降50%时特异性抗原与类似物的剂量（ED50）之比抗体交叉反应程度直接影

8、响测定结果的准确性特异性效价五、方法学评价除了常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性之外，应注意以下指标：可靠性剂量-反应曲线高剂量钩状效应第二节放射免疫分析一、放射免疫分析－基本原理竞争性结合反应的经典标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）与限量抗体(Ab)竞争性结合Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成