实验-两对半的检测

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1、ELISA检测“乙肝二对半”(EnzymelinkedimmunosorbentAssayELISA)酶免疫技术分类酶免疫组化酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定ELISA的概念酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）酶联：抗原或抗体的酶标记。免疫：以抗原抗体特异性反应为基础。吸附：抗原或抗体包被于固相载体表面。在固相载体表面实现抗原抗体的反应，通过酶标记的手段，酶催化底物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深

2、浅与标本中的抗原或抗体的量直接相关。ELISA技术特点具有良好的灵敏度和特异性，能满足临床需要，应用广泛。操作简单、无需昂贵的仪器投入，价格便宜。对环境几乎没有污染。ELISA技术的应用检测抗原的方法：双抗体夹心法竞争法检测抗体的方法：双抗原夹心法间接法竞争法捕获法实验目的掌握ELISA法检测“乙肝二对半”的原理、操作步骤及注意事项。掌握检测“乙肝二对半”的临床意义。什么是“乙肝二对半”？“乙肝两对半”是指：表面抗原（HBsAg）、表面抗体（HBsAb）、e抗原（HBeAg）、e抗体（HBeAb）、核心抗体

3、（HBcAb）HBsAg本身不具有传染性，只具有抗原性保护性抗体：HBsAb传染性指标：HBeAg，HBcAgHBeAb，HBcAb不是保护性抗体，而是反映曾被HBV感染的重要指标。为什么不检测核心抗原（HBcAg）HBcAg主要位于病毒颗粒中，只有少数游离。机体免疫系统对HBcAg很敏感，易产生高滴度的HBcAb,与HBcAg形成免疫复合物。血清中，HBcAg可丢失部分氨基酸。“乙肝二对半”的检测原理HBsAg：双抗体夹心法HBsAb：双抗原夹心法HBeAg：双抗体夹心法HBeAb：中和竞争法（血清中的e

4、抗体与固相e抗体竞争结合e抗原）HBcAb：竞争抑制法双抗原（体）夹心法测抗体（原）包被抗原*酶标抗原待测抗体包被抗体*酶标抗体待测抗原Anti-HIV,Anti-HBs双抗体夹心法双抗原夹心法HBsAg,HCVcoreAg,HBeAg,HBVpreS1,PreS2洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY竞争抑制法测抗体包被抗原待测抗体*酶标抗体Anti-HBcAnti-HBe中和竞争法测抗体包被抗体中和抗原待测抗体*酶标抗体Anti

5、-HBe试剂盒组成包被反应板：固相的抗原或抗体酶结合物：酶标记的抗原或抗体显色剂：分A、B二瓶终止液对照：阳性对照，阴性对照浓缩洗涤液中和试剂（只有检测HBeAb的试剂盒才有）实验准备配制洗涤液：用蒸馏水按1：20稀释浓缩洗涤液。为节省试验时间，除检测核心抗体（HBcAb）组外，其余组可在加样后的温育时间中才配制洗涤液。实验操作1、加样：第一、二孔为阴、阳对照孔，分别加入阴、阳对照50ul。其余各孔为样品孔，各加入待测标本50ul（检测HBcAb时，待测标本需用稀释后的洗涤液做1：30稀释）。2、加中和试剂

6、（只有检测HBeAb时才需要）：每孔50ul3、加酶结合物：每孔50ul4、温育：封板→充分混匀后置37°C水浴30分钟5、洗涤：弃去反应条孔内液体，用洗涤液注満每孔，放置或振荡1分钟，弃去拍干→反复5次（注意：最后一次一定要拍干）6、显色：每孔先加显色剂A50ul，再加显色剂B50ul，混匀后置37°C水浴10分钟7、中止显色：每孔加入中止液50ul8、判断结果：①目测法：反应孔颜色结果阴性对照透明无色阴性阳性对照黄色阳性样品黄色？？样品浅黄色？？样品透明无色？？HBsAg，HBsAb，HBeAgHBeA

7、b，HBcAb反应孔颜色结果阴性对照黄色阴性阳性对照透明无色阳性样品黄色？？样品浅黄色？？样品透明无色？？②比色法：波长450nm读取各孔OD值HBsAg，HBsAb，HBeAg样品OD值/阴性对照OD值≥2.1HBeAb，HBcAb阴性对照OD值/样品OD值≥2.1（建议双波长比色（450/630nm）；临界值的确定请参考实验指导，不同的试剂盒和检测原理，临界值的设定均不同）阳性阳性ELISA的注意事项标本：内源性（RF、补体、嗜异性抗体等）外源性因素（溶血、细菌污染、保存不当、凝集不全、防腐剂NaN3等

8、）（P229）试剂：试剂质量、批号、是否失效（冰箱温度）、平衡（37度°C30分钟）、摇匀加样：加样准确、不可太快，避免加在上部和产生气泡。温育：温度（定期观察与登记）、时间、湿度、封片（不可重复用）洗板：洗涤液用蒸馏水或去离子水现配、防止洗板机堵塞、洗完要拍板。显色：加试剂时不可重复加和漏加，或加在两孔之间，不要产生气泡，及时终止。比色：建议用双波长（可排除标本浓度、干扰色、电路干扰、板底部划痕的影响）。结果判