实习二红细胞、网织红细胞检测

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1、实验诊断实习二红细胞、网织红细胞检测目的和要求熟悉正常红细胞和网织红细胞的形态学特点掌握血红蛋白测定方法、参考值和临床意义掌握血细胞多参数报告单的正常值及其增减的临床意义红细胞计数(redbloodcellcount)红细胞计数是取一定微量血液，经稀释后计算出血液内所含红细胞数目原理：用等渗稀释液将全血稀释至一定倍数，充入血细胞计数池，在光学显微镜下计数一定体积内的红细胞数，经换算求出每升血液中的红细胞数量方法：显微镜计数法器材及试剂：取血吸管，一次性定量采血管(20ul)计数板：是一块厚玻璃制成，板上刻度分为9个大方格面积为

2、Imm2。中央大方格用于红细胞计数，被双线等分成25个中方格，每个中方格又划分为16个小方格。计数板与盖玻片组成计数池，计数池深度为0.1mm显微镜、盖玻片、刺血针、棉花等小试管、刻度吸管、红细胞稀释液。其它:75%酒精棉球及干棉球操作:取血：选择耳垂边缘或指端，先用75%酒精棉球消毒局部皮肤。等待干后，用消毒后的刺血针刺入皮肤，深约2毫米。待血液从针孔流出，用于棉花擦去第一滴血轻轻挤压，使血液流出形成绿豆大小的血滴。操作者用右手平拿取血吸管尖端浸入血滴中，缓缓吸血恰至“10”刻度处为止。然后用干棉花擦净吸管外沾附的血液稀释及

3、混匀先准备一清洁小试管，精确滴入红细胞稀释液1.99毫升，备用将取好的血液立即挤入上述试管中，并来回吸取小量稀释液数次，以便将残余在吸管中的血液全部洗净摇动试管，充分混匀。此时血液被稀释200倍充池先将计数板及盖玻片擦干净，并将盖玻片复盖于计数池上面。用吸管吸取己充分混匀的稀释血液一滴，滴于盖玻片的下方边缘处，稀释血液即充填入计数池中。注意勿发生气泡或使稀释血液流入计数池旁小槽内静置2－3分钟，待红细胞完全下沉稳定后进行计数计数平放计数板于显微镜台上，先用低倍镜找到计数池的中央大方格。观察红细胞是否均匀，并调整至视野中间。再转

4、换高倍镜计数。镜下红细胞为圆形或盘形、略带黄色的细胞。如将上侧线和左侧线上的红细胞都计数在内，则不要再将下侧和右侧线上的细胞计入。计数时必须按一定方向和顺序，以免将红细胞重复计数或漏数。计数5个中方格(即四角的及中央的中方格)由红细胞总共的个数，将其结果乘以10。即得每立方毫米血液中所含红细胞数目，再乘以10。即得每升血液中所含红细胞数目。每升血液中红细胞数目=五个中方格内红细胞个数×5(变为0.1u1)×10(变为1u1)×106(变为1L)×200(稀释倍数)=五个中方格内红细胞个数×1010清洁仪器：计数后，将盖玻片及计

5、数板用水冲洗干净，再用绸或细布擦干吸管先用蒸馏水，继用95%酒精，后用乙醚洗涤干净，保存备用注意事项不能在有水肿、炎症、淤血等部位或刺血过浅处采血所用吸管、试管、滴管及血细胞计数板须干净无水操作迅速，充池一次完成，不能有气泡红细胞分布不均，每个中方格之间相差大于20个时要重新充池计数血红蛋白测定方法：氰化高铁血红蛋白测定法原理：血红蛋白(Hb)被高铁氰化钾[K3Fe(CN)6]氧化为高铁血红蛋白（Hi），Hi与氰离子结合成氰化高铁血红蛋白（HiCN）HiCN在540nm有一吸收峰测定其光密度而得血红蛋白浓度[试剂与器材]器材：

6、分光光度计试管，试管架取血吸管:一次性定量采血管(20ul)刺血针蒸馏水75%酒精及干棉球试剂：氰化高铁血红蛋白稀释剂高铁氰化钾[K3Fe(CN)6]200mg氰化钾（KCN）50mg无水磷酸二氢钾140mgTritonX-1001.0ml用蒸馏水溶解并稀释　至1L该试剂应呈透明、淡黄色，pH在7.0～7.4之间，以蒸馏水作空白，在540nm比色，读数是0溶液应放置棕色试剂瓶中，塞紧后保存于冰箱中（但不宜冻结），至少可稳定数月如发现试剂变绿、浑浊则不能使用其中非离子表面活性剂可加速溶血，缩短转化时间，防止血浆蛋白改变引起的浑浊

7、[实验步骤]在试管中准确加入HiCN稀释试剂5.0ml，作为测定管用血红蛋白吸管准确吸取全血20u1，擦去管端血迹，置于试剂中，冲洗3次，混匀将混合液放置3分钟以后，倒入光径1cm比色皿，用分光光度计在540nm进行比色以蒸馏水或HiCN稀释试剂作空白管，校正光密度到0点，读取测定管光密度读数计算：血红蛋白（g/L）=测定管光密度×（64458/44000）×251=测定管光密度A×367.7式中：（1）64458是目前国际公认的血红蛋白分子量（2）44000是国际血液学标准化委员会公布的血红蛋白摩尔吸光度（3）251是稀

8、释倍数[方法评估]HiCN法操作简便，试剂单一，显色快且稳定，可以根据吸光度直接计算结果－－被列为国际血红蛋白测定的参考方法，也是我国推荐的首选方法高球蛋白血症和白细胞明显增高－－可导致反应液浑浊而影响结果[注意事项]用吸血管吸血过程应仔细、认真，准确把握住吸入的血液量是初学