检验技术化学发光和荧光免疫技术及仪器

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1、第十一章化学发光和荧光免疫技术及仪器1第一节化学发光免疫分析技术第二节　电化学发光免疫分析第三节　时间分辨荧光免疫分析法第四节　荧光偏振免疫分析法第五节　化学发光免疫分析的临床应用内容概述:2教学目标和要求掌握化学发光免疫分析技术的基本原理、反应的底物和标记方法以及反应类型。熟悉电化学发光免疫分析的基本原理和标记物，时间分辨荧光免疫分析法的基本原理及其标记物和螯合物。了解荧光偏振免疫分析法的基本原理和技术特点，化学发光免疫分析的临床应用3第一节化学发光免疫分析技术基本原理反应的底物标记方法反应类型相关仪器4一、基本原理化学发光，是指伴随化学反应过程所产

2、生的发光的发射现象。某些物质在进行化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应物分子形成电子激发态，当电子从激发态返回到稳定的基态时，多余的能量就以光子的形式发射出来。这一现象称为化学发光。A+BC*+D,C*C+h5(一)产生化学发光反应的条件和过程化学发光与荧光的区别:化学能光能化学发光反应的条件:反应必须提供足够的激发能焓变(△H)介于170～300kj·mol-1之间，才能在可见光范围观察到化学发光现象吸收了化学能后处于激发态的分子或原子，必须以光子形式将能量释放出来，或者将能量转移到另一种物质的分子上并使该分子激发，当被激发的分子回到

3、基态时，也以光子的形式释放能量6(二)化学发光效率化学发光反应的发光效率(φCl)又称为化学发光总能量的产生率φCl取决于生成激发态产物分子的化学激发效率(φCE)和激发态产物分子的发射效率(φEM)。一般化学发光反应，φCl值约为10-67(三)强度与反应物质浓度之间的关系反应物的浓度反应速度化学发光反应所发出的光的强度8(四)化学发光的反应类型直接化学发光间接化学发光1．直接化学发光化学反应释放的化学能激发的是反应产物分子A+BC*+D,C*C+h92．间接化学发光(敏化的化学发光)在化学反应中，激发能传递到另一个未参加化学反应的分子上，使该分子

4、达到电子激发态，再由激发态分子返回到基态时发光；或反应首先生成一种高能量的中间体，此中间体再将能量转移给另一个未参加化学反应的分子，使该分子达到电子激发态，再由激发态分子跃迁回到基态时发光的过程。A+BC*+D,C*+FF*+E,F*F+h10二、反应的底物(发光剂或发光底物)在化学发光反应中，参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物发光免疫技术中常用的化学发光底物:１．氨基苯二酰肼类主要有鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼，luminol)和异鲁米诺(5-氨基苯二甲酰肼，isolumino1)及其衍生物。2．眯唑类化合物较常用的是2，4，6-三苯

5、基咪唑，即洛粉碱(lophine)。3．吖啶酯类典型代表是N，N-二甲基二吖啶硝酸酯，即光泽精(1ucigenin)。4．苯酚类化合物其中主要有邻苯三酚，即焦性没食子酸。5．芳香草酸酯类主要有双-(2，4，6，-三氯苯基)-草酸酯(TCPO)和双-(2，4-二硝基苯基)-草酸酯(DNPO)。6．(金刚烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物1112三、标记方法化学标记生物标记化学标记:用于化学发光(酶)免疫测定直接用发光物质(如鲁米诺、吖啶酯类等)标记抗体或抗原以催化剂(如HRP、GOD等)和／或协同因子(如ATP、NAD等)标记抗体或抗原按照标记物的应用:1

6、3按照被标记物的结构或性质:对小分子物质(如甾体激素、药物等)的标记对大分子抗原、抗体的标记(如蛋白质、核酸等)以及对某些配基和载体的标记14按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点:直接偶联间接偶联通过偶联反应，使标记物分子中的反应基团直接连接在被标记分子的反应基团上。在标记物与被标记物之间插入一条链或一个基团，使两种物质通过这种引入的“桥”连结成结合物碳二亚胺缩合法、过碘酸盐氧化法、重氮盐偶联法和混合酸酐法琥珀酰亚胺活化法、O-(羧甲基)羟胺法、异硫氰酸酯衍生物和戊二醛法1516常用的标记方法1．碳二亚胺（EDC）缩合法此法可用于蛋白质分子中的游离

7、羧基或游离氨基的标记。常用的缩合剂有l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和二环己基碳二亚胺(DCC)直接偶联172．重氮盐偶联法(又称重氮化法)此法简易、成本低、重复性好，但不适用于脂肪伯胺基发光剂，因其生成的重氮盐不稳定，即使在０℃也会生成氮气。此外，ABEI等伯胺基位于侧链者也不适用此法。芳香伯胺直接偶联183．过碘酸盐氧化法标记物可用发光剂或催化剂，适用于芳香伯胺或脂肪伯胺发光剂，标记方法稳定标记物不易脱落，但此法不适用于无糖基的蛋白质和含有糖基但氧化后会影响免疫学活性的蛋白质。直接偶联194．戊二醛法间接偶联芳香伯胺基氨基由于

8、戊二醛在溶液中以单体和聚合体形式存在，后者占多数，所以在标记反应中双方分子间构成较大的距离，减