SNT1087-2011 Q热检疫技术规范.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１０８７—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１０８７—２００２犙热检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犙犳犲狏犲狉２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１０８７—２００２《牛Ｑ热微量补体结合试验操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１０８７—２００２相比，主要技术变化如下：———增加了病原分

2、离和鉴定；———增加了间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验方法。本标准同等采用世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《ＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＴｅｓｔｓａｎｄＶａｃｃｉｎｅｓｆｏｒＴｅｒｒｅｓｔｒｉａｌＡｎｉｍａｌｓ》（２００８版）中第２．１．１２章Ｑ热部分。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：鄢志强、柯忠哲、马保华、鱼海琼、林志雄、李贺、林宝珍、陈升毅、吕平、刘计亮、朱来华。本标准

3、所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１０８７—２００２。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１犙热检疫技术规范１范围本标准规定了Ｑ热的检疫规范，包括病原分离鉴定、血清学试验，其中血清学试验包括酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光试验和补体结合试验。本标准适用于进出境牛、羊等易感动物Ｑ热的检疫和诊断。２缩略语下列缩略语适用于本文件。ＱＦｅｖｅｒ：Ｑ热Ｃ．Ｂｕｒｎｅｔｉｉ：伯纳特柯克斯体ＥＬＩＳＡ：酶联免疫吸附试验ＩＦＡ：间接免疫荧光试验ＨＥＬ：人胚肺成纤维细胞ＣＰＥ：

4、细胞致病效应ＰＢＳ：磷酸盐缓冲液ＦＩＴＣ：异硫氰酸荧光素ＲＮＡ：核糖核酸ＯＰＤ：邻苯二胺ＯＤ值：光密度值ＶＢＤ：巴比妥钙镁缓冲液ＬＰＳ：脂多糖３临床症状Ｑ热临床症状及其他信息参见附录Ａ。４检疫方法４．１病原分离和鉴定４．１．１材料准备２细胞培养瓶、２４孔平底细胞培养板、４．１．１．１器材：荧光显微镜、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、２５ｃｍ带盖湿盒、组织捣碎机、冷冻离心机。４．１．１．２试剂：４．１．１．２．１无犆．犅狌狉狀犲狋犻犻抗体犊牛血清。４．１．１．２．２人胚肺成纤维细胞（ＨＥＬ）。１标准分享网www.bzfxw.com免费下

5、载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１０８７—２０１１４．１．１．２．３犆．犅狌狉狀犲狋犻犻标准菌株和标准阳性、阴性血清、犆．犅狌狉狀犲狋犻犻荧光抗体。４．１．１．２．４溶液及细胞培养液：见附录Ｂ。４．１．１．３１日龄～２日龄豚鼠。４．１．１．４链霉素、庆大霉素。４．１．１．５样品：胎盘子叶、肺、肝、流产胎儿皱胃内容物；母畜阴道分泌物、奶样、粪便。４．１．２样品的处理将样品剪碎，在组织捣碎机内捣碎，用含抗生素（链霉素１００μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ和庆大霉素５０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ）的ＰＢＳ磷酸盐缓冲液制成组织悬液，于

6、４℃作用４ｈ，３０００ｒ／ｍｉｎ离心后，保留上清液。４．１．３病原分离对无污染的样品，按常规方法培养ＨＥＬ单层细胞，倒去培养液，接种样品组织上清液，每样接种３瓶，每瓶接种１ｍＬ。于３７℃吸附２ｈ后加细胞维持液，封闭、置３７℃二氧化碳箱培养，２４ｈ后逐日在倒置显微镜下观察细胞病变，连续观察２１ｄ犆．犅狌狉狀犲狋犻犻特征性ＣＰＥ（细胞致病效应）：ＨＥＬ细胞空泡化。无ＣＰＥ的盲传２代。如有ＣＰＥ，则待７０％细胞出现ＣＰＥ时收毒，将细胞反复冻融２次，３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液４℃保存待鉴定。４．１．４培养物的鉴定５／ｍＬ的

7、细胞悬液，加入到２４孔细胞４．１．４．１将生长良好的细胞，用细胞分散液处理后，制备成２×１０培养板内，每孔３ｍＬ，封闭、置３７℃二氧化碳培养箱培养。４．１．４．２等细胞生长成８０％的单层，吸出孔内培养液，接种４．１．３待鉴定上清液，每孔３ｍＬ，每个样品２个孔；另外４．１．３上清液用适量犆．犅狌狉狀犲狋犻犻阳性血清中和后接种２个孔，每孔３ｍＬ；阴性、阳性和空白细胞对照方法同待检样品培养物，每个对照２个孔。４．１．４．３置３７℃二氧化碳培养箱吸附２ｈ。４．１．４．４吸出各孔内所加的待检和对照样品，加入维持液，每孔３ｍＬ，封闭、置３７℃

8、二氧化碳培养箱培养１０ｄ。４．１．４．５取出细胞板，ＰＢＳ漂洗，自然干燥后，用－２０℃预冷的丙酮固定３０ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗３次，每次５ｍｉｎ，自然干燥。４．１．４．６滴加适量犆．犅狌狉狀犲狋犻犻阳性血清，置３７℃作用１ｈ。４．１．４．７滴加适量犆．