SNT2707-2010-裂谷热检疫技术.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!"!#!"#""!#$#裂谷热检疫技术规范$%&'&()*(+,'-)-.-/0-''*0)1&//+20+1+'!#$#3$$3#$发布!#$$3#%3#$实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７０７—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：鱼海琼、鄢志强、林志雄、罗长保、林祥梅、韩雪清、罗琼、田纯见、梁

2、刚。Ⅰ犛犖／犜２７０７—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售裂谷热检疫技术规范１范围本标准规定了裂谷热病毒分离鉴定技术、微量血清中和试验方法、酶联免疫吸附试验方法和血凝抑制试验方法的技术要求。本标准适用于裂谷热的检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８出入境动物检疫采样ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求３缩略语下列缩略语适用于本文件。ＢＨＫ：仓鼠肾细胞ＣＥＲ：鸡胚网状组织细胞ＣＰＥ：细胞病变ＯＤ：

3、光密度ＰＢＳ：磷酸盐缓冲液ＲＮＡ：核糖核酸ＲＶＦ：裂谷热ＴＣＩＤ５０：组织培养半数感染量Ｖｅｒｏ：非洲绿猴肾细胞４临床诊断根据裂谷热临床症状和发病机理（参见附录Ａ）做出初步诊断，确诊还需进行实验室诊断。５实验室诊断警告：涉及传染性材料和病毒的部分要严格按照犌犅１９４８９的要求操作。５．１病毒分离和鉴定５．１．１材料５．１．１．１荧光显微镜。５．１．１．２二氧化碳培养箱。１犛犖／犜２７０７—２０１０２版权所有·禁止翻制、电子发售５．１．１．３２５ｃｍ细胞培养瓶，９６孔平底细胞培养板，带盖湿盒。５．１．１．４无ＲＶＦ抗体胎牛血清，细胞分散液。５．１．１．５

4、ＲＶＦ标准毒株和标准阳性、阴性血清，ＲＶＦ荧光抗体。５．１．１．６Ｖｅｒｏ细胞或ＢＨＫ细胞或ＣＥＲ细胞。５．１．１．７溶液及细胞培养液配制见附录Ｂ。５．１．２样品的采集按ＧＢ／Ｔ１８０８８规定，逐头进行采样，并按规定填写《送样单》送实验室。采集发热期动物的抗凝血５ｍＬ。对怀疑死于该病的动物采集死亡动物的肝脏、脾脏、大脑，流产胎儿５ｇ。５．１．３样品的处理血液用常规方法分离血清。死亡动物的肝脏、脾脏、大脑，流产胎儿经剪碎、研磨，加生理盐水，冻融两次，４℃过夜，离心取澄清样品上清液。５．１．４样品的培养取生长良好，形成８０％以上单层的细胞，倒去培养液，接种

5、处理好的样品，每瓶接种１ｍＬ，每个样品接种３个细胞瓶。置３７℃二氧化碳培养箱吸附２ｈ。倒去样品，加入维持液，３７℃二氧化碳培养箱培养６ｄ。收获病毒，同一样品３瓶混和，冻融两次后进行下一步鉴定。５．１．５样品培养物的鉴定将生长良好的细胞，用细胞分散液处理后，制备成２×１０５个／ｍＬ的细胞悬液，加入到９６孔细胞培养板内，每孔０．１ｍＬ，置３７℃培养。等细胞生长成８０％的单层，吸出孔内培养液，接种样品培养物，每孔０．１ｍＬ，每个样品４个孔。阴性、阳性和空白细胞对照方法同待检样品培养物，每个对照２个孔。置３７℃二氧化碳培养箱吸附２ｈ。吸出各孔内的所加的待检和对

6、照样品，加入维持液，每孔０．１ｍＬ，置３７℃二氧化碳培养箱培养３ｄ。取出细胞板，用ＰＢＳ漂洗，自然干燥后，用－２０℃预冷的丙酮固定１５ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗３次，自然干燥。滴加ＲＶＦ阳性血清，置３７℃作用１ｈ。滴加适量免疫荧光抗体，放进湿盒，３７℃作用２ｈ。用ＰＢＳ洗３次，倾去液体。荧光显微镜镜检。５．１．６结果判定结果判定如下：———阳性对照在显微镜下胞浆呈黄绿色，并见有黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内；———阴性对照、空白对照无荧光；———没有经过阳性抗体作用的细胞荧光较亮，形态清晰，而经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则判为阳性；２犛犖／犜２７０７—

7、２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售———没有经过阳性抗体作用的细胞荧光微弱，形态不清晰，经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则重检；重检后仍荧光微弱，形态不清晰，则判为阳性，重检后无荧光则判为阴性；———如果阳性对照无特异性荧光或阴性对照出现特异性荧光，则试验失败，应该重检。５．２微量血清中和试验５．２．１材料５．２．１．１溶液及细胞培养液配制见附录Ｂ。本方法使用的阳性血清、阴性血清和被检血清应经过５６℃３０ｍｉｎ灭活处理。５．２．１．２ＲＶＦ标准毒株和标准阳性、阴性血清。５．２．１．３Ｖｅｒｏ细胞或ＢＨＫ细胞或ＣＥＲ细胞。５．２．１．４无ＲＶＦ抗体胎

8、牛血清，细胞分散液。２标准细胞培养瓶，９６孔无菌细胞培养板，５０、１００微量可调移液器。５．２