《型PCR荧光分析仪》PPT课件

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1、1890型PCR荧光分析仪介绍及应用实时荧光定量PCR的应用临床方面的应用疾病的临床早期诊断建立病原体病分子诊断标准疗效考评指导制订感染性疾病合理治疗方案了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况医院、血站及防疫站的确诊新药研究中药物的作用效果研究Elisa方法的漏检率病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的测定，为疾病治疗进行指导遗传病诊断中的应用等位基因检测多基因遗传病的突变检测基因表达异常所致遗传病检测在肿瘤诊断中的应用肿瘤相关基因表达的检测肿瘤标志物（肽类激素和酶）肿瘤耐药基因（MDR）何谓

2、PCR?聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。试剂的定量原理：Roche杂交探针定量分子信标定量SYBRGreenⅠ染料定量Taqman水解探针定量PCR的发展史这项技术的发明人是KaryMullis。１９８３年，在一家生物高技术公司（Ｃｅｔｕｓ）工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段ＤＮＡ的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州１０１号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段ＤＮＡ的简单方法，即ＰＣＲ。

3、在１９８５年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了强烈的反应。Ｃｅｔｕｓ给了Mullis一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。在短短的几年内，ＰＣＲ迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。１９９３年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。PCR原理和方法:(一)众所周知，ＤＮＡ是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤Ａ对胸腺嘧啶Ｔ，鸟嘌呤Ｇ对胞嘧啶Ｃ）组成的螺旋双链。在细胞内，ＤＮＡ

4、复制时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，另一种酶--ＲＮＡ聚合酶合成一小段引物（ｐｒｉｍｅｒ）结合到ＤＮＡ模板上，最后，ＤＮＡ合成酶以这段引物为起点，合成与ＤＮＡ模板配对的新链。ＰＣＲ即是在体外模拟ＤＮＡ复制的过程，它用加热的办法让所研究的ＤＮＡ片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到ＤＮＡ模板的两端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量复制该模板。假定我们要研究的ＤＮＡ双链两端的序列是：TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT

5、ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA在ＰＣＲ之前，我们首先人工合成两段有２０－３０碱基的引物，能够分别与上下两条链的一端配对，比如一条是（为与模板能够区别，以小写表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一条就是tttacggatcggcaacctat。把这两段引物和ＤＮＡ模板、ＤＮＡ聚合酶、底物（四种脱氧核苷）混合在一起，我们就可以开始做ＰＣＲ了。PCR原理和方法:(二)第一步叫“变性”，把样品加热到９４－９６摄氏度一到数分

6、钟，让ＤＮＡ模板变性变成单链。第二步叫“退火”，让样品的温度下降到５０－６５摄氏度一到数分钟，引物就可以结合到模板上去。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTataagcccgaaaggttcgtttatccaacggctaggcatttATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA第三步叫“延伸”，让样品的温度上升到７２摄氏度一到数分钟，ＤＮＡ聚合酶就可以从引物开始

7、用底物复制出新链。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTataagcccgaaaggttcgttGATC........…CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCtatccaacggctaggcatttATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA这样经过三步一个循环，一条双链就变成

8、了两条，再来一个循环，就变成了四条……在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了２的３０次方倍，而这只需要两三个小时。影响PCR特异性的因素退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以