基因的体外重组和转化

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1、第五章基因的体外重组和转化第一节DNA片段的体外连接第二节重组体导入细菌细胞磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶第一节、DNA片段的体外连接连接方式：黏性末端的连接平头末端的连接修饰黏性末端的连接PCR产物的连接Gateway载体构建体系一、黏性末端的连接黏性末端连接(Cohesiveendligation)：具有黏性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下,连接成为一个杂合双链DNA。1.同种酶产生的黏末端的连接优点经济省时，操作方便；外源片段容易回收；问题载体自身环化插入片段可双向插入2.不同限制酶酶切产生黏末端的连接载体和目的基

2、因分子上有两个相同的酶切位点载体和目的基因只有一个相同的限制酶识别位点无相同的限制酶识别位点，有同尾酶SalⅠ片段（CAGCTG）XhoⅠ片段(GAGCTC)G3’CAGCT5’C3’GAGCT5’DNA连接酶讨论：连接后的重组分子还能被这两种限制酶切割么？？若均不是以上情况呢？二、平末端的连接平末端连接(bluntendligation)：在T4DNA连接酶的作用下，将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。平端连接AGCTTCGAAluⅠT4DNA连接酶AGCTAGCTTCGATCGA优点可以用T4连接酶连接任何DNA平端5’-突出粘性末端

3、的补齐可用Klenow聚合酶补齐3’-突出粘性末端的削平可用T4DNA聚合酶削平主要问题连接效率低高浓度的底物和T4DNA连接酶添加凝聚剂：如聚乙二醇不易回收外源DNA片断双向插入三、修饰黏末端连接同聚物加尾法：同聚物加尾(homopolymertailsjoining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工粘性末端,然后在DNA连接酶的作用下,连接成为重组的DNA。优点①不会发生自身环化作用；②连接效率较高；存在问题操作繁琐外源片段难回收可能会影响基因表达衔接物连接法衔接物（linker）是指用化学方法合成的一

4、段由8～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。DNA接头法：DNA接头（adapter）是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。人工接头连接BamHIBamHIBamHI讨论如何将一平末端的DNA片段与BamHⅠ形成的粘性末端连接？（P156.4）四、PCR产物的连接1.限制性内切酶酶切位点引入法在引物上添加或引入限制酶识别位点，使PCR产物两端带有相应的限制酶识别位点，进一步与相应载体进行连接。（1）在引物上添加酶切位点！！注意①添加保护序列Primer1:5'GCGGgga

5、tccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5‘GCGGggatccTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC②引入的酶切位点是单一的（2）利用突变在引物5‘端引入酶切位点通过在PCR引物序列的5’端突变一个或几个碱基，创造出限制酶识别位点的方法。2.T-A克隆利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在70～75℃活性高)，使PCR产物的3′末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3′粘性末端含一个T的线性克隆载体中.3′5′T载体3′5′载体T3′5′3′5′AAPCR产物Taq酶PCR扩增+3′3′5′PCR产物AA

6、5′T载体TT5′5′3′3′连接转化蓝白筛选目的片段T载体的构建：用限制性内切酶如XcmI,HphI,与MobII酶切产生3‘末端未配对的T；应用末端转移酶与双脱氧TTP加入一个突出的T残基到线形化载体的3’末端。应用不依赖末端的TaqDNA聚合酶的末端转移酶活性在线形化载体的3‘末端出的羟基基团上催化连接上一个T碱基。五、Gateway载体构建系统Gateway技术：一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（EntryVector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Desti

7、nationVector，目的载体）上。Gateway技术的灵活性：整合后的附着位点为attL（BOP’）attR（POB’）整合位点---attBattP切除位点---attLattR整合过程需要介导蛋白和重组位点。第二节、重组体导入细菌细胞转化(transformation):受体细胞捕获并表达质粒DNA的生命过程；转染(transfection):受体细胞捕获并表达噬菌体DNA的生命过程；转导(transduction):重组体包装成噬菌体导入受体细胞的过程。重组体的转化受体细胞重组体的转化受体细胞的选择（1）具有接受外源DNA的能力；（2）限制酶缺

8、陷型；（3）DNA重组缺陷型；（4）不适于在人体内或非培养条件下生