微生物产丁醇代谢

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1、微生物产丁醇代谢微生物的产丁醇代谢摘要：丁醇作为一种传统工业原料，自二战前就开始被广泛应用，是印染、医药、香料等的重要原料。传统上用石油产品作为生产原料，如今，丁醇被赋予了新的用途，即汽车等燃料的替代品。为了节约成本，加强环保，各个实验室开展了生物法制丁醇的研究。本文介绍了微生物产丁醇的一些菌种，以及产丁醇代谢的过程，最后介绍了现在的应用状况以及前景。关键词：丁醇厌氧发酵汽油10梭菌简介丙酮丁醇是一种重要的有机溶剂和化工原料，广逆用于喷漆、炸药、塑料、制药、植物油提取及有机玻璃、合成橡胶等工业[2,3,4,11~17]。目前生产方法有化学合成和发酵法两种[

2、13]：发酵法产丁醇曾经是世界上仅次于酒精发酵的第二大发酵产业[2,9]，而现在常用的是石油产品进行化学合成。石油资源紧缺而导致的石油价格持续上涨已成为不可逆转的趋势[12]，而丁醇作为一种替代的清洁性能源，其生物学制法越来越受到关注。国内生产生物丁醇(ABE发酵)主要是以玉米为原料，利用丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)发酵[7]，而国外一般使用拜氏梭菌，用蜜糖为发酵原料[8]。梭菌属严格厌氧，能形成芽孢、厌氧生长的革兰氏阳性杆菌。因芽孢常比菌体大，致使菌体呈梭状而得名，又称厌氧芽孢杆菌属。现在已知的梭菌都是产生正丁醇的，

3、近期，美国杜邦公司和加州大学发现一种使用藻类产生异丁醇的工艺，现在处于保密阶段。本文中如无特指，丁醇均是指正丁醇。1.发酵原理丙酮丁醇发酵包括2个不同的时期：产酸期和产溶剂期。产酸阶段，细胞处于指数生长期，主要产生乙酸、丁酸、H2和CO2，有机酸的产生引起了发酵液pH的下降；随着有机酸积累到一定阶段（pH达到4.3~4.5），发酵进入产溶剂期，此时细胞处于稳定期，产生的乙酸和丁酸在这一阶段转变为ABE，随着发酵10的进行，丙酮丁醇梭菌开始衰老，活力下降，加上底物的消耗，溶剂的毒害作用，使菌体开始自溶或生成孢子，发酵逐渐由微弱最终达到静止结束[11]。如图1

4、，是整个产丁醇的反应的流程及相关酶类。图1产丁醇代谢流程及相关酶如上图，梭菌中有几种特殊的酶，对产丁醇代谢起着关键的调节作用[11]。在反应的整个代谢途径有3个重要的中间代谢产物：乙酰-CoA、乙酰乙酰-CoA和丁酰-CoA，这3个产物引起了有机酸和溶剂的产生。因此，推动这三种物质产生的酶是整个反应的关键酶。通过基因沉默实验也验证了这一假设[9]。2.菌种筛选及产物的测定2.1菌种筛选目前，丙酮-丁醇发酵主要的菌种选育手段是诱变育种。由于初筛得到的菌种往往丁醇产率及耐受能力很差，需要经过诱变二次筛选才有实用价值。目前常用的方法为2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选

5、。通常使用的诱变剂为N+离子[3]，亚硝酸亚硝基类[7]等。流程如图2。图2诱变育种流程图原始菌种通过初筛得到，采用沼气池发酵液、10牛粪、土壤作为菌种来源。通过富集培养——有大量气泡和醪盖的培养基进行气象色谱；以及分离纯化——稀释到10-8，滚管技术分离单菌落，TYA培养基（用于厌氧菌培养）培养就可以初步得到有产丁醇能力的菌种。此外，还可以进行工程菌种的构建[11]。如E.Coli工程菌构建。近年来，人们利用基因工程技术对大肠杆菌的代谢途径进行加工改造，构建的大肠杆菌工程菌能够产生丙酮、丁醇。Bermejo等人构建丙酮的操纵子cet4(adc，ctlAB

6、和th1)的质粒pACT，并成功转化大肠杆菌，首次在大肠杆菌中构建了产丙酮的工程菌，工程菌发酵后能够产生丙酮。另外，Atsumi、Inui等人分别克隆了丙酮丁醇梭菌中合成丁醇途径的关键基因thl、hbd、crt、bcd-etf、B-etfa、adhE，使其控制的硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶和醛／醇脱氢酶在大肠杆菌中成功表达，工程菌发酵后产生丁醇。2.2发酵工艺及产物测定丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)可产α淀粉酶，能利用淀粉质原料生产丁醇，α淀粉酶酶活与其产丁醇的能力之间存在一定相关性，丁醇抗性株C.ac

7、etobutylicumSA-1的丁醇产量提高是由于α淀粉酶酶活力提高。α淀粉酶酶活的提高可以加快10C.acetobutylicum利用淀粉转化为丙酮丁醇，提高发酵法生产丙酮丁醇的产量[9]。葡萄糖和果糖可使延滞期缩短，但是抑制α淀粉酶活性[13]。采用萃取发酵、气提发酵、膜分离发酵、吸附发酵等手段与丙酮、丁醇发酵工艺相耦合。丁醇发酵的主要产物测定是丁醇，但由于副产物像丙酮等对菌体生长有很大危害，因此也需要测定其含量。首先采用精馏法分离产物，然后利用气象色谱分析产物含量，如图3，是简略的流程图，用的是目前比较好的发酵与气提分离耦合工艺[2]。图3发酵与气

8、提分离耦合工艺示意图3.应用状况及展望3.1生物制丁醇发展史生物制