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1、基于多光子激发荧光-毛细管电泳的DNA分析新技术2期陈胜,等:基于多光子激发荧光一毛细管电泳的DNA分析新技术3571.2试剂DNA样品:P1:5一TTAGGGTTAGGGTTAGGGTT—AGGG一3和P,:5一CCCTAACCCTAACCCTAACCC—TAA一3(北京奥科生物技术有限责任公司),P和P为5端FITC修饰.荧光素异硫氰酸酯(FluoresceinIsothioCyanate,FITC),Rh6G,RhB,SRh,coumarin,calcein和APTS(MO.UsA),十水合四硼酸钠(天津市石英钟厂霸州市化
2、工分厂),硼酸(武汉联碱厂),丙酮(天津博迪化工有限公司),NaOH(-11:京化工厂),HC1(武汉市亚泰化工试剂有限公司),所用水均为Direct—Q系统过滤的超纯水,除特殊注明外,所用试剂均为分析纯或以上,且所有溶液使用前都进行过滤处理(400nm).DNA样品与FITC缩合衍生反应,通过检测FITC的荧光就可以间接实现对DNA样品的分析.1.3方法毛细管处理:对多种荧光染料分离,每次进样前分别以0.1mol/IHC1,0.1mol/L氢氧化钠,水和25mmol/L硼砂(pH9.50)溶液,冲洗石英毛细管(57cm×75m
3、)10min;对DNA分离,每次进样前分别以0.1mol/IHC1,0.1mol/I氢氧化钠,水和2HEC/1×TBE/20rnmol/L冲洗石英毛细管(57cm×75/,m)10min,再用10APVA对处理后的毛细管进行表面改性;进样方式:对多种荧光染料进样:采用虹吸进样,15cm/60S,对DNA进样:电动进样,一6kV/10S.实验条件:电泳实验前,毛细管需要先进行高电压平衡10min.PMT工作电压为1000V;数据处理采用Matlab处理;分离电压为20kV,半导体激光器功率为800mw,采用100倍油镜进行柱后检测
4、,将物镜焦点对准在阴极端毛细管出口的中心.2结果与讨论2.1多种荧光染料的毛细管电泳分离和多光子激发荧光检测多光子激发荧光理论上可以实现宽谱激发.通常情况下,一个分子或者原子每次只能吸收一个光子,从基态跃迁到激发态.当光强足够高时,就会产生多光子跃迁,即一次可以吸收多个光子.以荧光物质的双光子吸收为例(图1):荧光分子同时吸收两个相同频率的光子,被激发至高能级,经过一个弛豫过程后发生自发跃迁,辐射出一频率略小于两倍入射光频率的荧光光子.由此推出:采用多光子激发荧光~2147,可以用单线激光取代多线激光,能有效降低系统成本.激发原
5、理如图2,高能量的350nm的光子激发的荧光与吸收两个近红外的700nm的光子图2单光子激发和多光子激发原理比较图Fig.2Parallelillustrationoflaserinducedfluorescenceandmuhiphotonexci*edfluorescence激发的荧光一样:这样可以看出,只要有足够能量的700nm激光,可以实现从激发波长在350～690nm以内的,多光子激发效率高的荧光试剂的同时多光子荧光激发.因此,多光子激发可以实现超宽谱线激发,即同时实现多种不同激发波长荧光试剂的激发.本文选取了6种荧光
6、染料分子,其荧光参量如表1.如果采用单光子激发则需要多种波长的激光器,如果采用多光子激发荧光,可以同时实现激发和荧光收集.表1荧光染料的光谱参量染料名称最大激发波长/nm最大发射波长/nm基于此种分析,本文构建了一套毛细管电泳一连续光多光子激发荧光检测分析系统,并对上述6种荧光染料进行了分离分析.结果表明,该系统可以实现不同激发波长物质的同时测量.图3给出了电泳谱图,峰图标号和浓度分别为:Peakidentity:1.rhodamine6G(0.14mM);2.rhodamineB(0.2mM);3.sulforhodamine
7、(0.2mM);4.calcein(0.03mM);5.coumarin(0.2mM):6.APTS(0.17mM);Buffer:Time/min图3毛细管电泳连续光多光子激发荧光检测分析荧光染料Fig.3Electropherogramofsmall—moleculedyestuffsusingCWbasedMPEfluorescencedetectionbyLDlaser9876OOOOOOOOj.【su3luI..8.∞.Iold358光子37卷15mmol/Iborate(PH9.50).根据图3,可以确认,本文建立的
8、分析系统可以满足复杂体系分离分析的要求,尤其是对于多荧光标记体系如DNA测序等.2.2DNA分析为进一步探讨应用本系统进行DNA分析的可能性,本文进行了模型实验.对FITC标记的DNA样本(含2段等碱基长度的DNA片段)进行了毛细管电泳分离和基于连续光多光子激发
