《DNA合成原理》PPT课件

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1、寡聚核苷酸背景介绍寡核苷酸的化学结构寡核苷酸的用途寡核苷酸的化学合成原理寡核苷酸的纯化方法DNA的化学结构双连螺旋结构1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，“生命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径核酸A（腺嘌呤）、G（鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）、U（尿嘧啶）、T（胸腺嘧啶）核苷酸脱氧核苷酸核苷磷酸戊糖：核糖碱基：A、G、C、U脱氧核苷磷酸戊糖：脱氧核糖碱基：A、G、C、TBase=A,G,C,TBase=A,G,C,U脱氧核苷酸核苷酸T胸腺嘧啶ThymineA腺嘌呤AdenineG鸟嘌呤Gua

2、nineU尿嘧啶UracilC胞嘧啶CytosineG鸟嘌呤C胞嘧啶T胸腺嘧啶A腺嘌呤寡聚核酸的用途PCR扩增DNA测序亚克隆，点突变基因建构（全基因合成）反义核酸多聚酶链式反应PCR：PolymeraseChainReactionPCR是由美国科学家穆利斯(KaryMullis)提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。基本反应步骤：高温

3、变性→低温退火→适温延伸。寡核苷酸的化学合成原理目前，oligoDNA的合成一般都采用固相亚磷酰胺三酯法，亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上，经过四步循环反应：脱保护、耦连、加帽、氧化，逐一将一个一个核苷酸单体连接上去，最终完成DNA链的合成。此法具有高效、快速偶联、起始反应物比较稳定的优点。该方法的特点：•第一个核苷酸是3’固定在固相载体上•每一个核苷酸依次连接上去•DNA合成的方向是3’→5’•合成是在疏水环境中进行dA-phosphoramiditedT-phosphoramiditedG-phosphoramiditedC-phosphoramidite1

4、.脱DMT（Detritylation）CPG：Controlledporeglass，可控微孔玻璃珠，作为寡居核苷酸依附的固体载体。2.耦连（Coupling）活化（Activation）b.耦连（Coupling）3.加帽（Capping）耦连中未反应核苷酸链已加帽核苷酸链4.氧化（oxidation）核苷酸的纯化方法在所有合成循环结束后，就得到一个目标DNA片段粗品，首先需经过氨解步骤，然后再通过各种方式进行纯化。氨解切割：将合成好的寡聚核苷酸从固体载体（CPG）上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG上连接化合物与初始核苷间的酯键。脱保护基：将合成好的寡聚核

5、苷酸上的各个碱基与磷酸上的保护基脱掉。一般用新鲜的浓氨水来处理较长时间以脱掉氰乙基（P）、苯甲酰基（dA、dC）、异丁酰基（dG）。纯化C18柱脱盐纯化OPC纯化PAGE纯化HPLC纯化C18柱脱盐纯化C18柱上一种活性炭柱子，又称为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。优点：所有纯化方法中最简单的一种。缺点：不能有效去除比目的片段短的小片段，前提是合成效果很好时才能选用此法。OPC纯化利用OPC柱中装有对DMT基团具有特殊亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5’端最后一个碱基上的DMT，所有合成产物吸附在OPC柱

6、上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有DMT片段的吸附能力强，不易被洗脱，不带有DMT的片段吸附能力弱从而被洗脱，然后用酸脱去吸附在OPC柱上DNA的DMT，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。优点：方便、快捷。缺点：其专一性吸附DMT能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小，特别是对长于25个碱基以上的片段纯化效果不好。PAGE纯化聚丙烯酰胺凝胶电泳法，利用不同长度片段DNA在凝胶中迁移率不同来分离大小片段。由于各分子所带电荷和大小不同，综合影响其在凝胶中的迁移速度，大片段迁移速度慢，待目的片段与缺碱基片段分开后，经过剥离凝胶，切割目的片段，浸泡碎胶，再从泡胶的盐溶液

7、中回收目的DNA。优点：纯化效果好，尤其是纯化长链效果好。缺点：费时费力，样品损失大。HPLC纯化HPLC根据吸附介质分为反相柱和离子柱。反相柱是根据疏水性的差别来分离的，即疏水性更强的长片段比短片段吸附能力更强，后出峰；离子柱上根据不同长度寡核苷酸带有不同净电荷，较长的片段带有高电荷比带有电荷低的短片段在离子柱内流动得慢，从而依次将不同片段洗脱出来。优点：自动化程度高，省人力，纯化效果好，纯度可达99%以上，特别是在标记引物和特殊修饰探针纯化中效果好。缺点：纯化量小，不能纯化长片段，设备昂贵。各纯化方法的比较纯化方法优点和缺点C18柱脱