《CR实验教程》PPT课件

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1、实验二质粒DNA的提取及电泳检测一、实验目的了解并掌握质粒DNA的原理和方法通常用的质粒DNA分离方法有2种：1、碱裂解法2、煮沸法本实验介绍的是碱裂解法小量提取质粒DNA。二、实验原理二、实验原理在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大量蛋白质等可被除去，而质粒

2、DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可以用RNA酶清除。再用酚/氯仿处理，可以除去残留的蛋白质。原理成分：NaOH,SDS成分：醋酸钾，冰乙酸三、操作流程1、分离质粒DNA2、电泳鉴定四、实验操作过程（鼎国）1、取1500ul过夜培养的菌液，加入离心管中，12000rpm，离心1分钟，尽量吸除上清。2、加250ul溶液A，剧烈震荡。3、加250ul溶液B,温和颠倒4-6次，静止2min4、加取350ul溶液C,立即温和颠倒混匀4-6次。静止2分钟。12000rpm，离心10分钟。（注：制胶）1、分离质粒DNA5.将上清置于离心柱中，静置2min。6.1200

3、0rpm，1分钟，弃废液。7.加入500ul溶液D,12000rpm，1min，弃废液。8.加入500ul溶液E,12000rpm，1min，弃废液。9.12000rpm，再次离心2min10.将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖子放置5-10min。11.向吸附膜中部加50ul溶液F,静置2分钟。12.12000rpm，离心2分钟，管底即为收到的DNA.2、电泳鉴定（1）制备1%琼脂糖凝胶（方法如实验一）（2）上样、电泳、观察现象五、实验结果Marker超螺旋状质粒DNA线状质粒DNA图1质粒DNA电泳检测图DNA