动物细胞培养的生物学知识

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1、细胞工程云南大学生命科学学院林洁主讲linjie@ynu.edu.cn组成人及哺乳类动物机体的细胞具有极其复杂的结构和功能，细胞在机体内生长时相互依赖、相互制约，在神经体液的调节下形成了一种天然的内环境，体外生长时脱离了这些内平衡系统，与机体内细胞相比不完全相同。细胞体外生长时，有其特有的生长类型、特点、过程和所需的生长条件。第三章动物细胞培养的生物学知识第一节体外培养细胞的生长方式及类型第二节体外培养细胞的生长特点第三节体外培养细胞的生长和增殖过程第四节体外培养细胞的生长条件第五节体外培养细胞生长的监

2、测方法第一节体外培养细胞的生长方式和类型体外培养的动物细胞，按照其生长方式可以分为：1.贴壁生长型细胞（贴壁型细胞）2.悬浮生长型细胞（悬浮型细胞）1.贴壁生长型细胞贴壁生长是大多数由机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。贴壁有两种含义：一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外基质结合。动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞必须附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满表面。而从生长表面脱落进入液体的细胞通常不再生长而逐渐退化，这种细

3、胞培养称为单层附壁培养。贴壁生长型细胞的生长一般都经历游离期、吸附期、繁殖期和退化期。贴壁培养的细胞可用以蛋白酶、酸、碱等试剂或机械方法处理，使之从生长表面上脱落下来。1.贴壁生长型细胞在体外，细胞的贴壁方式与体内也不相同，体外培养细胞需要附着于某些带适量正电荷的固体或半固体表面，大多是只附着一个平面，因而体外培养的细胞的外形一般与在体内时明显不同。按照贴壁型细胞的体外培养时的形态，主要分为四大类：成纤维细胞型细胞上皮型细胞游走型细胞多形型细胞此型细胞外形与体内成纤维细胞形状相似，细胞大致呈梭形或不规则

4、形。起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为这种形式。人胚肺细胞在显微镜下观可观察到典型的成纤维细胞型。成纤维细胞型细胞此型细胞形状上类似上皮细胞，扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形及不规则偏平的多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞。起源于内胚层与外胚层的细胞在体外培养时都可能呈现上皮型。血管内皮细胞、Hela宫颈癌细胞在显微镜下可呈现典型的上皮细胞型。上皮型细胞此型细胞具有类似巨噬细胞样的特征：在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成群落；细胞胞质常伸出伪足和突起；在培养皿壁上生

5、长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则；细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。表现此类细胞形态的主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞和肿瘤细胞。游走型细胞此型细胞形态上不规则，一般分为胞体和胞突两部分，其中胞突为细长形，类似丝状伪足；胞体虽然也略呈多角形，但没有成纤维细胞那样不规则。此类细胞不常见，只有某些神经组织细胞等那以确定其稳定形态的才归入多形细胞。多形型细胞上述四种细胞形态学形式是细胞体外培养最常见的、也是形态最明显的几种形式，体外培养时所谓的某型细胞，仅是因为其形态与体内的某种

6、细胞类似，而不能将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同，同时也不能说明培养细胞的起源。在实际培养中，所培养的细胞并不一定呈现某一种典型的形态形式，而多呈现的是一些过渡性形态。体外培养细胞的形态学特征受到多种培养条件的影响，因此，细胞形态学特征仅是对培养物判断或识别的一种参考性指标，不能用于确定某一培养物的确切细胞类型。重要提示2.悬浮生长型细胞此类细胞在体外生长时可在培养基中悬浮生长，不必贴壁，因此也叫非贴壁型细胞。悬浮培养类似微生物的深层培养。由于是悬浮生长，细胞密度一般都较高，培养的效率也高、

7、操作也容易，易于大规模生产，便于过程的控制；大规模培养可采用培养微生物细胞用的发酵罐，但须将其稍加改进，如将搅拌速度减慢，搅拌叶改用螺旋桨式、通气装置通过硅橡胶管扩散的方式等。一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞，当接种于体外环境中，也可以以悬浮状态生长，这类细胞的胞体始终为球形。还有一些细胞，在体外培养时，即可贴壁生长，也可悬浮生长。第二节体外培养细胞的生长特点体外培养细胞重要的生长特点包括：1.贴附与伸展2.运动的接触抑制和生长的密度抑制1.贴附与伸展贴附并伸展是大多数体外培养细胞的基本生长特点，大

8、多数的哺乳动物细胞在体外均附着于一定的底物而生长。当培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等在体外，细胞贴附的底物可以是其它细胞、胶原、玻璃或塑料等。一些促细胞附着因子（例如纤维连接蛋白、层粘连蛋白、血清扩展因子、III型胶原等）可以促进细胞与底物的附着。一般来说，从底物脱离下来的贴附生长型细胞，不能长时期在悬浮中生长，除非是一些转化了的细胞或恶性肿瘤细胞。细胞的