分子生物学许晓东1

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1、6分子生物学研究方法（下）——基因功能研究技术6.1基因表达研究技术基因表达系列分析技术RNA的选择性剪接技术原位杂交技术基因定点突变技术6.1.1基因表达系列分析技术SAGE（serialanalysisofgeneexpression）是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。LongSAGE技术。标签来自转录物3’端一段21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。其原理与Short

2、SAGE方法类似，只是用了不同的IIS类标签酶（MmeI），并将程序做了相应修改。锚定酶(AnchoringEnzyme,AE)要求至少在每一种转录物上有一个酶切位点，一般4碱基限制性内切酶能达到这种要求，因为大多数mRNA要长于256碱基。NlaIII每一种接头都含有标签酶(TaggingEnzyme,TE)酶切位点序列(标签酶是一种Ⅱ类限制酶，它能在距识别位点约20碱基的位置切割DNA双链)。BsmFIMmeI6.1.2RNA的选择性剪接技术RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。可分

3、为：平衡剪切、5’选择性剪切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基因是否存在选择性剪切。果蝇Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体选择性剪切的不同类型a.平衡剪切b.5’选择性剪切c.3’选择性剪切d.外显子遗漏型剪切e.相互排斥性剪切RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切6.1.3原位杂交技术原位杂交（insituhybridization,ISH）是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量

4、研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。荧光原位杂交（FISH）首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。mRNA的互补链，杂交信号集中于纤维细胞中。负对照，mRNA的同义链,无杂交信号。正

5、对照，UBQ10杂交信号遍布于整个胚珠。原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达MultiplexRNAvisualizationincellsusingViewRNAFISHAssays6.1.4基因定点突变技术通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。寡核苷酸介导的DNA突变技术重叠延伸介导的定点诱

6、变大引物诱变法6.2基因敲除技术6.2.1基本原理经典遗传学（Forwardgenetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。现代遗传学（Reversegenetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。基因敲除（geneknock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。完全基因敲除是指通过

7、同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞HSV-tk:HerpesSimplexVirusThymidineKinaseCre重组酶和LoxP序列:Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λInt酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的

8、基因序列被删除或重组。LoxP（locusofX-overP1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了L