分子生物学--基因工程与基因体外表达

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1、全国高等医药教材建设研究会卫生部规划教材全国高等学校教材供七、八年制临床医学等专业用医学分子生物学MedicalMolecularBiology主编冯作化人民卫生出版社2005年8月第一版课件制作：吴耀生(版权所有)广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室2008.10第十三章基因工程与基因体外表达GeneEngineeringandGeneExpression目的与意义1.获得感兴趣的目的基因2.研究基因结构特征3.表达基因产物4.研究基因功能基本要素1.目的基因(targetgenes)2.工具酶(toolenzymes)3.载体(vectors)

2、4.宿主细胞(hostcells)Maincontents工具酶DNA载体基因克隆过程真核细胞基因转染基因改造克隆基因表达电子克隆基本概念及背景ForExample如何从植物中克隆法呢基焦磷酸合酶(FPS)?1.查资料认识FPS2.设计实验方案3.可行性分析ForExampleFPS克隆：RT-PCR，3'-RACE，5'-RACE改进的异硫氰酸胍一步法提取三七根部总RNART-PCR扩增fps部分保守序列3’-RACE及克隆测序5’-RACE及克隆测序序列拼接mRNA:5’AAAAAA3’TTTTTTT-接头cDNA:OligodT接头基因特异性引物3’Fu

3、llRACE原理图5’FullRACE原理图(1)P5’-端磷酸化RT-Primer未知区域已知序列TargetmRNAAAAAAAAA-----5’AAAAAAAA-----5’P未知区域逆转录RNA分解P未知区域未知区域S1A1S2A21stPCRprimers2ndPCRprimers用RNAligase进行环化或形成首尾连接物未知区域1stand2ndPCR5’-端磷酸化RTprimer部位包含未知的5‘上游区域的扩增产物(2)(3)(4)ThankYouDNA重组DNArecombinationSomeconcernedconcepts:DNA重组技

4、术DNArecombinationtechnique分子克隆Molecularcloning基因工程Geneticengineering克隆Cloning三大理论基础1953年，Watson和Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制原理，解决了基因的自我复制和传递的过程。40年代，O.T.Avery等通过肺炎链球菌转化实验发现遗传物质的携带者是DNA而不是蛋白质50年代末到60年代初，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流向和表达问题。三大技术发明DNA分子的体外切割与连接技术1970年Smith,Wilcox

5、流感嗜血杆菌(Haemopbilusinfluenzae)HindII1972年BoyerEcoRI“GAATTC”1967年世界上5个实验室几乎同时发现了DNAligase1970年T4DNAligase大肠杆菌转化体系的建立----复制工厂基因工程载体的使用：plasmid,phage,viruses1978年Nobel医学与生理学奖TheNobelPrizeinMedicinewasawarded,in1978,toDanielNathans,WernerArber,andHamiltonSmithforthediscoveryofrestriction

6、endonucleases.TheirdiscoveryleadtothedevelopmentofrecombinantDNAtechnologythatallowed,forexample,thelargescaleproductionofhumaninsulinfordiabeticsusingE.colibacteria.Over3000restrictionenzymeshavebeenstudiedindetail,andmorethan600oftheseareavailablecommerciallyandareroutinelyusedfor

7、DNAmodificationandmanipulationinlaboratories.DNAligaserepairingchromosomaldamage.ligaseI,DNA,ATP-dependent第一节基因克隆是利用工具酶进行操作工具酶(Toolenzymes)----用于对DNA分子进行定点切割、连接、扩增、标记等操作的特殊酶类，已被纯化并商品化进行应用一、限制酶(RE,restrictionendonuclease)二、其他工具酶(othertoolenzymes)一、RE在基因克隆中用于切割DNARE(restrictionenzyme,

8、restrictionendonucl