《酵母菌的基因工程》PPT课件

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1、5.2酵母菌的基因工程发展历程1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统优势在于：安全无毒，不致病；有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；容

2、易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；培养条件简单，容易进行高密度发酵；5.能将外源基因表达产物分泌到培养基中；有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。缺陷在于：表达效率相对低2.酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工修正。5.2.1酵母菌的宿主系统广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌4.减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母克鲁

3、维酵母属如乳酸克鲁维酵母毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母汉逊酵母属如多态汉逊酵母其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变突变产生的异源蛋白增加产量（倍数）作用位点SSC1凝乳酶原Ca2+-ATPase牛生长因子3-10转录后SSC2凝乳酶原转录后牛生长因子rgrl鼠α—淀粉酶5-10转录后oselβ—内啡肽7-12转录后NDS人血清蛋白溶酶原活化剂抑制因子2型10转录ss1lα1—抗胰蛋白酶P人溶菌酶10羧肽酶Y

4、rho人溶菌酶10转录人表皮因子NDE抑制超糖基化作用的突变宿主菌许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。突变类型生物效应mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天门冬酰胺侧链糖基化缺陷och外侧糖链添加缺陷型酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用靶蛋白靶蛋白靶蛋白LysLysUbiquitin76aaLysLysHO

5、OCUbiquitinligaseE3UbiquitinligaseE3蛋白酶体减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素降解途径衰减的酿酒酵母UBI4缺陷型：在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。UBA1缺陷型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。Ubc4-ubc5双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。5.2.

6、2酵母菌的载体系统载体的一般结构选择标记复制子表达盒启动子先导序列终止子有用的蛋白结构域1酵母菌中的野生型质粒2酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌种的野生型质粒酿酒酵母中的2μ环状质粒几乎所有的酿酒酵母都含有2μ双链环状质粒，拷贝数维持50-100个。Irs反向重复序列600bp，重组FLP编码产物驱动Irs的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性STBREP的结合位点接合酵母属中的pSRI、pSR1、pSB2和pSR1以及克鲁维酵母属中的pKD1质粒等，均有类似的结构。酵母菌种的野生型质粒乳酸克鲁维酵母中的线性质粒乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双

7、链线性质粒pGKL1和pGKL2，拷贝数为50-100个，分别携带K1和K2两种能致死宿主细胞的毒素蛋白基因。酵母菌克隆表达质粒的构建含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建ARS为酵母菌中的自主复制序列，大小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp就有一个ARS元件。由染色体ARS构成的质粒称为Yrp，而由2μ质粒构建的杂合质粒为Yep。上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但是经过几代培养后，质粒丢失率达50%-70%，主要由于分配不均匀所致。酵母菌克隆表达质粒的构建含有CEN的YCp质粒的构建CEN为酵母菌染色体DNA上与

8、染色体均匀分配有关的序列。将CEN插入到ARS质粒中，获得的新载体称为YCp。YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数通常只有1-5个。酵母菌克隆