冻干血小板在深Ⅱ度烫伤大鼠模型中对创面愈合作用分析

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1、万方数据硕士学位论文目的将血小板浓缩液进行冻干处理后制备成FDP，并将其应用于大鼠深II度烫伤创面的愈合，观察FDP使用后创面的愈合情况，以验证FDP外用治疗烫伤的疗效，为其进一步应用于临床提供实验依据。方法1、FDP的制备(1)PRP的制备采用无偿献血者捐献的全血，按国家标准检验合格后进行血小板分离，1500xg离心10min分离出上层富含血小板血浆，再将此富含血小板血浆经3000xg离心20min，分离出上层贫血小板血浆和下层富血小板血浆，用贫血小板血浆来调整后者血小板的浓度，直至计数为1000x109／L备用。(2)PRP的冻干处理预处理液的配制：采用NaCI、KCl、CaCl2Mg

2、S04、NaHC03、柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸钠、葡萄糖、超纯水、海藻糖及可逆性血小板激活抑制剂，调PH为6．6～6．8，0．22“m滤器过滤；冻干缓冲液的配制：血小板预处理液中加入总体积30％的同型血浆，调PH为6．6"-'6．8，0．22“rn滤器过滤后备用。血小板1500xg离心15min，弃去上清，保留下层血小板沉淀物，用与弃去上清相同体积的预处理液重悬血小板，37℃水浴振荡4h，使血小板保持悬浮状态。4h水浴后，将血小板悬液再以1500xg离心15min，弃去上清，保留下层血小板沉淀物，用与弃去上清相同体积的冻干缓冲液重悬血小板。将预处理后血小板悬液转移到硅化玻璃瓶中，每瓶4ml，

3、置于．80"C超低温冰箱中冷冻过夜，次日将冻于机打开并使温度降至．45"C后，再将样品从．80。C超低温冰箱取出，转入冻干机进行真空干燥，冷阱温度为．45+5。C，真空度<133mbar，24h后取出，并将其密封后保存于室温。(3)冻干血小板复水化检测室温下保存1d以上的样品将其复水化，复水化液为贫血小板血浆III万方数据摘要(platelet。poorplasma，PPP)：无菌水=3：1(V／V)，加入4ml复水化液后的样品，轻轻振荡至完全溶解，用血细胞计数仪分别测定冻干前及复水化后血小板计数和平均血小板体积(meanplateletvolume，MPV)，并计算血小板回收率与MPV冻

4、干前后差值：检测血小板冻干前及冻干后dO、d10、d30生长因子VEGF、TGF一13、PDGF-BB的释放含量。2、SD大鼠深II度烫伤模型的建立及FDP用于创面治疗的效果研究将40只大鼠背部脱毛，脱毛面积4cm×6cm左右，用清水洗净，观察24h，确定脱毛部位皮肤无红肿、炎症和破损等异常情况。次日，SD大鼠禁食8h以上，用10％水合氯醛腹腔注射进行麻醉，剂量为300mg／kg，麻醉生效后将大鼠固定于操作台，75％酒精消毒备皮区域。将不锈钢锅盛水置于电磁炉上，并将509的砝码置于锅内加热至沸腾，持续5min。用止血钳夹住砝码上端立即置于大鼠脊柱两侧备皮区，稍加压力，维持15s，即可形成半

5、径为lcm的圆形深II度烫伤创面；根据临床烧伤处理常规，3h后行削痂术，直至创面由苍白变为红润为止。将造模成功的40只大鼠随机分成四组，再根据组别进行上药。FDP组：将每瓶冻干血小板用4mL同型血浆复溶，与葡萄糖酸钙以10：1的比例混合进行激活后，喷洒于无菌纱布上，制备成血小板凝胶纱布(1mL／仓U面)，无菌纱布包扎；PI冲组：调整血小板浓度为1000×109／L，其他操作步骤同FDP组；烫伤膏组：无菌棉签直接涂抹后，无菌纱布包扎；空白组：仅用无菌纱布浸湿生理盐水包扎。换药时间分别为d1、d3、d5、d7、d9、d13、d19，换药同时用透明坐标纸覆盖创面，沿创缘画膜，计算创面面积，并每组

6、随机选取一个创面，取直径约为lcm的创面组织用于组织学检查(HE染色)。结果在血小板冻干效果评价中，冻干前后血小板数量和MPV存在着统计学的差异，细胞回收率为87．24％；生长因子VEGF、TGF一13和PDGF—BB释放量随着保存时间的延长并未有统计学上的差异，但PDGF—BB的含量在冻干前后有所差异(P<0．05)。IV万方数据硕士学位论文在动物实验中，不同处理组对大鼠烫伤创面愈合率的影响结果表明，在治疗过程中，烫伤创面结痂面积逐步减小，愈合率显著上升。在治疗的d7，PRP组与FDP组均使大鼠烫伤创面面积明显缩小，具有明显的促进创面愈合作用，与实验对照组差异有显著性(P<0．05)，而

7、PI冲组FDP组之间无明显差异。提示FDP具有与PRP相近的促进烫伤创面早期愈合的作用。不同处理组对大鼠烫伤创面病理组织学的影响。100倍镜下观察d1的组织标本：皮肤损伤至真皮深层，细胞水肿，变性坏死，正常结构消失，呈空洞状，胶原纤维断裂，已符合深II度烫伤的判定标准，提示造模成功；用药d7：FDP组和PRP组表皮及真皮组织均有明显的改善，皮肤创面的坏死组织及炎性渗出物显著减少，毛细血管周围有许多新生的成纤维细胞，可见大