反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌八种药物耐药性的分析

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1、万方数据南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表

2、。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》，并按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。作者签名：年月日导师签名：年月日万方数据反向斑点杂交技术快速

3、检测结核分枝杆菌八种药物耐药性的研究摘要:耐药结核病尤其是耐多药结核病（multi-drugresistanttuberculosis，MDR-TB，）及广泛耐药结核病（extensivelydrugresistanttuberculosis，XDR-TB，）的出现和流行成为了全球重点关注的公共卫生问题及社会问题。长期以来，以细菌培养为基础的传统药敏试验被视为金标准广泛应用于临床，但其耗时长，结核病患者在初期得不到及时有效的治疗而延误病情。新兴的分子生物学方法在部分一线抗结核药物中已经取得了良好的检测效果，几乎可以与表型药敏试验相媲美，但它们需要特殊的

4、仪器试剂，且在二线药物检测中应用较少。而反向斑点杂交（Reversedotblothybridization,RDBH）是一种基于基因扩增上的分子杂交技术，具有快速、简便、高效、直观等特点。本研究旨在建立一种能同时检测结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）对四种一线和四种二线抗结核药物耐药性的RDBH技术，以实现耐药结核病的全面快速检测，为有效防治耐药结核病提供新的技术手段。分别针对结核分枝杆菌八种药物，包括四种一线抗结核药抗结核药异烟肼（Isoniazid，INH）、利福平（Rifampicin，RIF）、链霉素（

5、Streptomycin，SM）、乙胺丁醇（Ethambutol，EMB）和四种二线抗结核药氧氟沙星（Ofloxacin，OFX）、卡那霉素（Kanamycin，KAN）、阿米卡星（Amikacin，AMK）、卷曲霉素（Capreomycin，CPM），I万方数据主要耐药相关基因及常见的突变位点，设计合成46条氨基标记的特异性寡核苷酸探针。通过小样本试验优化RDBH技术条件，建立RDBH技术，并对326株和170株MTB临床分离株分别进行一线、二线抗结核药物耐药性检测，采用比例法药敏试验和DNA测序结果作对照，初步评价该技术的检测效能。经过实验条件的反

6、复优化，最终确定了探针序列、探针终浓度为0.5M、杂交盐离子浓度为5×SSPE/0.1%SDS、最适杂交温度60℃、洗膜温度50℃、POD-TMB为显色体系。同时应用比例法药敏试验、DNA测序和RDBH技术分别对326株和170株MTB临床分离株进行了INH、RIF、SM、EMB四种一线抗结核药物和OFX、KAN、AMK、CPM四种二线抗结核药物的耐药性检测，以比例法作参照，RDBH检测INH、RIF、SM、EMB、OFX、KAN、AMK和CPM的敏感度分别为84.5%（185/219）、86.5%（166/192）、72.3%（120/166）、5

7、5.4%（51/92）、62.8%（59/94）、56.0%（14/25）、61.5%（8/13）和45.0%（9/20）；特异度分别为95.3%（102/107）、95.5%（128/134）、91.3%（146/160）、82.1%（192/234）、100.0%（76/76）、100.0%（145/145）、98.7%（155/157）和99.3%（149/150）；Kappa值分别为0.75、0.80、0.63、0.37、0.60、0.68、0.57和0.37；以DNA测序为为参照，八种药物耐药性检出率分别为97.9%（189/193）、97.

8、7%（171/175）、97.8%（134/137）、82.0%（91/111）和93.7%（