《血清学诊断技术》PPT课件

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1、鸡病血清学检验一原理许多病毒具有凝集动物红细胞的能力,这种凝集能力可被相应的抗体所抑制,故可用已知病毒检测相应的血凝抑制抗体.也可以用已知标准抗体对分离的病毒进行鉴定.红细胞凝集抑制试验二使用范围新城疫、禽流感、减蛋综合征、鸡毒支原体、滑液囊支原体等病原微生物感染后的抗体检测；或相应病原分离后的鉴定三器材1.血凝板、2.微量移液器3.标准抗原4.1%红细胞悬浮液5.被检血清6.稀释液四操作程序（一）0.5％――１％红细胞的准备1.阿氏液(抗凝剂)的配制葡萄糖1.866ｇ柠檬酸钠0.8ｇ柠檬酸0.055ｇ氯化钠0.418g蒸馏水10

2、0ml混匀放入100ml葡萄糖瓶内，10磅115度10分钟高压灭菌。冷却后4℃保存备用。2.采血取健康鸡翅静脉或心脏采血，(按阿氏液2份，血液1份）注意:(1).两只健康的鸡血混合;(2).阿氏液的量要够3.红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转/分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的细胞加稀释液（生理盐水）洗涤，再用离心机3000转/分钟离心5-10分钟，充去上清液，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞，按1%的稀释度加入稀释液（1毫升红细胞泥加99毫升稀释液

3、）。(二)．被检血清将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内（微量法可用孔经2-3毫米塑料管由翅静脉采血），在室温中静置或离心，待血清析出后使用。注意:每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。(三）血凝抗原效价测定（操作量25ul）(1)抗原一般以鸡新城疫II系或Lasota系作为已知抗原。来源:1).购买:目前也有用聚乙二醇使Lasota系病毒液浓缩，作成稳定浓缩抗原，HA效价达1：5000以上，4℃半年不变。2)自制:A.用鸡新城疫II系或者Lasota系疫苗接种鸡胚制备抗原：B.疫苗用灭菌生理盐水稀释1

4、0倍，以0.1毫升接种于10日龄的鸡胚尿囊内;C.凡接种后72-120小时内死亡的鸡胚，且病变显著者，分别收获鸡胚尿囊液于消毒试管内，如有血细胞应离心（2000转/分钟）15分钟，取上清液;D.作HA试验，其凝集价在1：640以上的鸡胚鸡，分装于洁净干燥的青霉素瓶中，保存于冰箱备用。2.抗原血凝价的测定每种抗原做两排，结果取均值1).1-12孔加生理盐水25ul2).第1孔加抗原25ul，反复吹打10次吸取25ul到第2孔，依此类推倍比稀释至第11孔3).最后从第11孔吸取25ul弃去,第12孔做生理盐水对照4).所有孔加25ul

5、1％红细胞5).将血凝板振荡1分钟6新城疫病毒室温（18℃—22℃）作用30分;禽流感病毒37℃作用30分.夏季结果出现快，冬季较慢新城疫病毒时间长，温度高易发生洗脱7结果判定1).完全凝集孔为终点2).将血凝板成45°角竖立观察3).红细胞呈泪滴状沉淀为不凝集4).孔底没有红细胞沉淀,红细胞均匀平铺于孔底为凝集,此孔稀释倍数为1个工作单位孔号12345678910稀释倍数5102040801603206401280对照生理盐水（毫升）病毒液（毫升）4*12525252525252525252525252525252525(25)

6、弃去生理盐水（毫升）252525252525252525250.5%红细胞液（毫升）25252525252525252525作用温度与时间混合均匀置18~22℃作用45~60分钟，对照管出现结果时判定结果（举例）++++++++++++++++++++++++++++++--鸡新城疫红细胞凝集试验（HA试验）(过程图)注意能使鸡红细胞完全凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例，病毒病的HA效价为1：320。（四)红细胞凝集抑制试验1.抗原准备（工作浓度的准备）红细胞凝集抑制试验（HI试验）时，病毒抗原液2

7、5ul内需含4个凝集单位，所以，应将原菌抗原毒作成320/4=80倍稀释。2操作步骤(1)每孔加25ul的稀释液:第1孔加25ul待检血清，反复吸吹10次;吸取25ul于第2孔，以此类推倍比稀释至第11孔;最后从第11孔取25ul弃去,第12孔为抗原对照;(3)每孔加4单位抗原;室温下(18-22℃)作用30分(4)取1％红细胞25ul加于各孔中(5)将血凝板振荡1分钟(6)室温作用30-45分钟（禽流感37℃）观察结果(7)结果判定将血凝板呈45°竖起观察完全抑制孔红细胞呈泪滴样下沉,此孔为抑制终点.鸡新城疫红细胞凝集抑制试验（

8、HＩ试验）(过程图)孔号12345678910稀释倍数１２３４５６７８９对照生理盐水待检血清２５２５2525252525252525252525252525252525(25)弃去4单位抗原252525252525252525250.5%红细胞液（