《蛋白质表达》PPT课件

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1、基因工程表达蛋白质的基本原理和应用mRNA的生物合成蛋白质生物合成原核生物表达系统真核生物表达系统蛋白质的纯化方法遗传信息的传递过程转录转录翻译DNARNAmRNA蛋白质基因表达蛋白质生物合成的基本原理参与蛋白质生物合成的物质包括:1、三种RNAmRNA（messengerRNA）rRNA（ribosomalRNA）tRNA（transferRNA）2、20种氨基酸作为原料3、酶及众多蛋白因子4、ATP、GTP、无机离子等mRNA的生物合成(转录)目的基因RNA聚合酶启动子转录终止信号转录因子等等启动子是DNA分子可以与RNA取聚合酶特异结合的部位

2、,也就是转录开始的部位。某个基因是否表达决定于特定的启动子的起始转录。以开始转录生成RNA5’端第一个核苷酸的位置为1,以负数表示上游的碱基数，正数为下游碱基数。转录的起始点不是翻译起始点。启动子原核生物启动子5’-TTGACG--TATAA--起始位点-3’-35区-10区+1（A、G）Pribnow框真核生物启动子5’----GC---------CAAT-----TATA---起始位点----3’-80~-110区-75区-25区+1（A、G）Hogness框-35区与-10区之间的距离大约是16~19bp，小于15bp或大于20bp都会降低启

3、动子的活性。强启动子-10和-35区之间的间隔为17±1bp，增加或减少都能明显影响启动子强度。-10区与-35区的最佳间距在克隆基因上游设置调节型强启动子是一个高效的蛋白质表达系统最基本的条件。不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多mRNA，弱的则相反。外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有害，因为这一过程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞的必要的生理功能。带有表达克隆基因的质粒，在几次细胞分裂后往往会丢失。解决的办法：引入强启动子并控制克隆基因在宿主细胞生长周期的某一特定时期发生转录，并且持续特定的时间。调节型强启动子转录终止信号即终止子，其作用

4、是使RNA聚合酶在DNA模板的特异位点终止RNA的合成。转录终止信号(DNA)3'-GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAA-5'(RNA)5'-CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUU-OH-3‘通常只要有一个核苷酸的改变，破坏了规则的双螺旋的茎时，即可破坏终止子的功能。茎环结构使转录终止的机理使RNA聚合酶变构，转录停止；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。5´pppG5335RNA聚合酶转录起始点TATA盒CAAT盒GC盒增强子AATAAA切离加尾转录终止点修饰点外显子翻译起始点内含子RNA

5、聚合酶蛋白质的生物合成（翻译）mRNA起始翻译受下列因素影响mRNA的核糖体结合位点AUG前后的核酸序列SD序列(Shine-Dalgarno）UAAGGAGGUSD序列位于mRNA5`末端非翻译的前导区内，其起点距翻译起始密码AUG上游约3-11个bp（-3—-11bp）。SD序列与16srRNA3’末端碱基AUUCCUCC互补，控制翻译的起始。二者互补的程度以及SD序列与起始密码间的合适距离(一般是8个bp）都影响mRNA的翻译效果。mRNA5`-------UAAGGAGGU-----AUG16SrRNA3`-------AUUCCUCCA--

6、-----mRNA的核糖体结合位点大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3`-端的互补性DB序列5'-AUGAAUCACAAAGUG-3‘DB序列（downstreambox）位于起始密码下游，16SrRNA的1469-1483碱基互补。这个序列也影响mRNA的起始翻译。真核生物无SD序列，但是有一个Kozak序列，这个序列影响真核mRNA的起始翻译。这个序列-3位的A最重要，而且在+4位最好是嘌呤，G是最优的碱基。AUG前后的核酸序列G  C  CAC  CA U GG-6 -5 -4 -3 -2 -1 1  2  3  4遗传密码与tRN

7、A除了极个别情况,遗传密码在所有的有机体内是相同的,但是不同的有机体内不同密码子的使用程度不同。而这种不同是由于tRNA在不同的机体内的丰度不同。•N端fMet或Met的切除•二硫键的形成•特定氨基酸的修饰•切除新生肽链中非功能片段•多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程•糖基化，磷酸化等等蛋白质前体的加工不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋白质需定位于细胞内的特异区域，或者分泌出细胞。分泌性蛋白都有一段信号肽，即在蛋白质合成过程中N端有一15~36个氨基酸残基的肽段---信号肽，它能引导蛋白质的肽链到达并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切除。

8、相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分泌要简单得多。蛋白质的分泌一些信号肽的一级结构蛋白的分泌（一）蛋白的分泌