利用基因工程技术表达蛋白质ppt培训课件

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1、第四章利用基因工程技术表达蛋白质本章的重点内容：1.什么是基因工程？2.获得目的基因的方法有哪些？3.DNA双脱氧测序技术的基本原理。4.PCR技术的基本原理及其应用。5.基因定点突变技术及其应用。6.表达载体的构建策略与技术方法。7.如何根据蛋白质氨基酸序列获得其基因？第一节基因工程原理简介一、基因工程的定义本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此

2、研究目的基因的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。目的基因获得表达载体构建基因的导入整合与表达的鉴定二、基因工程的基本步骤表达产物的提取、纯化与鉴定第二节基因工程中的方法学一、基因工程的基本技术（一）无菌操作技术（二）核酸的提取纯化1.RNA提取纯化技术；2.DNA提取纯化技术；3.plasmid提取纯化技术。（三）核酸电泳技术1.琼脂糖凝胶电泳2.SDS-PAGE（四）感受态细胞的制备与转化真核细胞总RNA的电泳结果：核酸电泳技术1.琼脂糖凝胶电泳2.SDS-PAGE50

3、0200010007501002001DL2000marker2BamHI和EcoRI双切3BamHI单切4HindⅢ单切5重组质粒pVAX1/ABPS112345二、一些重要技术原理介绍重点介绍DNA双脱氧测序技术，核酸探针技术，PCR技术等。（一）DNA双脱氧测序(二)核酸杂交技术（probe）1）原理；2）标记物；3）种类；4）应用1.Dotblot2.Southernblot：DNA3.Northernblot:RNAWesternblot:Protein（三）PCR技术1.基本原理2.引物设计1)长度;2)GC%;3)stem-loop;4)dimer

4、;5)错配;6)5’末端可以不配对3.应用:科学研究；医学与兽医临床。KaryB.MullisLaJolla,CA,USA.B.1944DNA生物合成与PCR方法合成DNA的异同点:1.相同点：均为酶促反应；均需要模板和引物；底物为dNTP；半保留复制；均为5’3’方向复制。2.不同点：1）反应条件不同：体内为生理条件，体外为94℃、52℃及72℃等变温条件；2）参与反应的物质种类和数量不同；3）引物不同，体内为RNA，体外为DNA，且在DNA合成后，前者被切除掉，后者作为终产物的一部分；4）体内为半不连续合成，体外为连续合成；5）体内单复制原点或多复制原点，单

5、方向或双方向复制；6）体内受细胞周期的调控，体外按人们的意愿进行；7）体内具有校正、修复的功能（错配率较低），体外无（错配率较高）；8）体内DNA的复制为全部染色体DNA的复制，体外仅复制两引物之间的DNA序列。（四）目的基因的改造技术1.引物介导的基因定点突变技术2.盒式突变(cassettemutagenesis)3.GenesShuffling三、基因工程中的工具（一）载体1.质粒(plasmid)2.粘粒(cosmid)3.λ噬菌体(λphage)（二）工具酶1.限制性内切酶2.外切酶3.连接酶4.聚合酶:klenowI5.核酸酶（三）宿主菌DH5,J

6、M101,JM109;DE3等四、获得目的基因的方法基因文库（基因组文库和cDNA文库），化学合成，PCR等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技术。（一）基因组文库目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组基因或调控序列的克隆等。家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆和序列分析特异性探针噬菌斑原位杂交鉴定可疑阳性克隆亚克隆文库液转化KW251噬菌斑三次纯化噬菌斑原位杂交λ-DNA提取阳性克隆单酶切和双酶切SouthernBlotHindIIIXhoI目的DNA片段测序序列分析技术路线:结果1:GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAACAAGAAGTCA

7、CCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGAT

8、TTGGAAGATCTC