《药基基因工程》PPT课件

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1、基因工程技术(Geneticengineering)2.基因工程（geneticengineering）：在分子水平上用人工方法提取或制备DNA，在体外切割，与载体连接成重组体，然后采用一定方法把重组的DNA分子导入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要表达不同的蛋白产物或定向的创造生物的新性状，并使之稳定的遗传给子代。一、基本概念1.基因（gene）：是生物体传递遗传信息和表达遗传信息的基本单位。目前认为它是合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部核苷酸序列。分：目的基因

2、的获取、载体的选择切：限制性内切酶的应用接：用连接酶将目的基因和载体连接重组体转：将重组体导入到受体细胞筛：采用适当的方筛选出含有目的基因的阳性克隆表：目的基因在受体细胞表达，获取表达产物二、基因工程的基本程序：分、切、接、转、筛、表GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAG分切接转筛表三、基因工程实验特点及要求1.微量操作2.连续性操作3.低温操作4.防止污染（杂质污染、细菌污染）5.实验物品切忌乱扔乱丢6.认真写好实验纪录第一次实验:质粒DNA大量制备、浓度分析第二次实验：DNA限制性

3、内切酶消化、电泳、片段回收、重组连接第三次实验：重组质粒的转化、PCR第四次实验：重组质粒的鉴定（质粒DNA小量快速制备）、杂交第五次实验：显色、考试实验一质粒DNA大量制备、浓度及纯度分析目的：获得高浓度、高纯度的质粒DNA。为酶切和基因转染作准备。质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的环状双链DNA,能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。载体的选择标准能自主复制；具有遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶

4、切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。基本步骤：细菌的生长和质粒的扩增:将表达质粒DNA的活细菌进行大量培养。细菌的采集和裂解,抽提质粒DNA：碱变性法提质粒；质粒DNA的提纯:除蛋白质、RNA和与质粒DNA分子量相近的断裂染色体DNA。碱变性抽提质粒DNA原理：利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同，变性和复性的差异。在pH=12.6的NaOH-SDS环境下，质粒DNA与染色体DNA的氢键均破坏，但是染色体DNA断裂成线状，而质粒DNA仍为闭环，且相互缠绕没有分开。当pH

5、调整到7.0，质粒DNA复性存在溶液中，而染色体DNA不能复性与变性的蛋白质、SDS相互缠绕形成沉淀，经离心被分离。质粒DNA的纯化：蛋白质的清除：蛋白质的变性剂——酚和氯仿.RNA的清除：RNA酶消化；LiCl沉淀;层析。与质粒分子量相近的线状断裂的染色体DNA的清除：等体积1.6mol/LNaCl,13%PEG;CsCl梯度超速离心等。CsCl密度梯度超速离心法：CsCl是一种高分子量的重金属盐，在较长时间超速离心后，形成浓度梯度，当DNA的沉降速度与扩散速度达到平衡时，染色体DNA、质粒、

6、RNA等各分离颗粒，在密度梯度中沉降或漂浮。他们在密度梯度中的位置分布不依据沉降速率、分子大小及离心时间，而是取决于密度。EB是一种丫啶类染料，可嵌入双链DNA的碱基之间，使DNA的解旋体积增大，浮力密度变小。EB与环状质粒DNA的结合量小于线状染色体DNA的结合量，故质粒DNA的浮力密度大与线状染色体DNA,位于离心管的下层。RNA总是与Cs+结合，密度最大，超离时位于管底。Sepharose2B柱层析法（琼脂糖凝胶柱）利用分子筛效应，分子量大的分子不能进入凝胶颗粒网孔，顺着颗粒间隙先流出，分

7、子量小的分子进入凝胶颗粒孔经内，流程长，后流出来。质粒DNA分子量大于RNA，故先洗脱下来。LiCl沉淀法：Li+可与RNA结合，形成锂盐沉淀，而DNA不与锂结合，故经离心可将二者分离。注意在变性阶段，操作要温柔，不要使染色体DNA断裂。聚乙二醇沉淀法：只沉淀环状DNA操作步骤:收集细菌GET悬浮SDS-NaOHpH=12.6碱变性KAcpH=4.8质粒DNA完全复性染色体DNA不能复性离心上清:质粒,小分子RNA,少量蛋白质沉淀:染色体DNA,大分子RNA,SDS-蛋白质复合物取上清,加等体积

8、异丙醇沉淀DNA(缩小体积)离心沉淀溶于TE等体积LiCl沉淀RNA离心加等体积酚氯仿异戊醇去杂蛋白离心,取上层水相酚氯仿异戊醇重复一次离心,取上层水相2倍体积无水乙醇0.1体积NaAc沉淀DNA离心70%乙醇清洗沉淀晾干TE(50ul)溶解沉淀取5ul电泳鉴定取上清,加等体积异丙醇沉淀DNA(缩小体积)离心沉淀溶于500ulTE，RNA酶消化30minDNA片段的琼脂糖凝胶电泳分离原理　以琼脂糖为电泳支持物，DNA因分子大小、形状、构象不同，在相同的电泳条件下，因迁移率不同而被分离。DNA可与