叶绿素的提取分离定量以及理化性质的探究

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1、叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定生命科学学院09级生物学基地班王栋一、实验目的1、掌握提取和分离叶绿体色素的方法2、掌握测定叶绿体色素含量的方法3、熟悉叶绿体色素的理化性质及吸光特性4、了解植物叶绿体色素组成及其与生境的相关性二、实验原理1、叶绿体色素是绿色植物将光能转化为化学能的重要物质，一般包括叶绿素和类胡萝卜素，而前者包括叶绿素a和叶绿素b，后者包括β—胡萝卜素和叶黄素。叶绿体中的色素具有吸光的性质，可用分光光度计在某一特定波长下测定色素溶液光密度，并由此计算出各个色素的含量。叶绿体色素主要

2、吸收高波长的红橙光和低波长的蓝紫光。2、叶绿体色素不溶于水，但能溶于有机溶剂，利用不同种类色素脂溶性不同的特点，可以用乙醇或丙酮提取色素，用不同的有机溶剂萃取或用色谱法进行分离。3、利用四种叶绿体色素极性和分子量的差异，以四氯化碳为展开剂可以将四种色素彼此分离。4、利用以下公式可以计算各种叶绿体色素的含量：①Chla（μg/ml）=12.7OD663－2.69OD645Chlb（μg/ml）=22.9OD645－4.68OD663ChlT（μg/ml）=Chla+ChlbCX·C=（1000OD470－3.2

3、7Chla－104Chlb）/229　　　　式中Chla、Chlb：叶绿素A、B的浓度；CX·C：类胡萝卜素的总浓度；OD663、OD645和OD470：叶绿体色素提取液在波长663nM、645nM和470nM下的消光度。②0.1ml提取液中ChlX含量（μg）=ChlX（μg/ml）×0.1ml×稀释倍数（30）③ChlX含量（μg/g）=0.1ml提取液中ChlX含量（μg）×100÷样品鲜重5、叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，且叶绿素中的镁不稳定，易被其他元素替代。三、实验材料、药品和用具新

4、鲜菠菜叶片、玉米叶片；丙酮、四氯甲烷、浓盐酸、30%KOH-甲醇溶液、醋酸铜晶体、乙醚、蒸馏水剪刀、研钵、分光光度计、滤纸、分析天平、试管若干、烧杯若干、量筒、移液管、胶头滴管四、实验操作1、提取叶绿素分别称取菠菜叶片2.0g和玉米叶片0.2g，如下操作：剪碎材料加入5ml丙酮及少许CaCO3和石英研磨、匀浆定容提取液至10ml过滤加入5ml丙酮搅拌2、吸光值测定与定量分别取0.1ml两种色素提取液，用80%丙酮稀释到3ml，测定菠菜叶片色素提取液400—700nm范围内的吸光值（以10nm为间隔），测定玉米

5、叶片色素提取液645nm处和663nm处的吸光值。根据公式计算叶绿素的含量。3、叶绿素的分离A、取圆形定性滤纸一张，用毛细管吸取叶绿体色素提取滴在圆形滤纸中心（20次左右），使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，保证叶绿素扩展速度均匀。在圆形滤纸中心戳一圆形小孔（直径约3mm），将做好的纸捻一端插入圆形滤纸的小孔中，另一端与滤纸刚刚平齐（勿突出）。在培养皿中加入适量的四氯化碳，把带有纸捻的圆形滤纸平放在培养皿上，使纸捻下端浸入展开剂中。迅速盖好培养皿。展开剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向

6、四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。B、取长形滤纸一条，也点样后层析分离。将长形滤纸放入盛有四氯化碳大试管中，进行层析后获得线形不同色素条带，分别剪下后溶于80%丙酮，测定400—700nm吸收光谱。4、叶绿体色素理化性质探究A、荧光现象：取叶绿体色素提取液少许与试管中，分别用反射光（俯视试管）和透射光（面朝光源举起试管）照射，观察现象。B、光的破坏作用：取叶绿体色素提取液少许，稀释2—5倍后分装于两个试管，分别置于黑暗中和强光下（光照培养箱中），2—3小时后观察试管中颜色的变化。C、铜代反应：取上述色

7、素提取液少许于试管中，一滴一滴加6N的浓盐酸，直至溶液颜色出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液，则又产生较深的绿色。此即形成了铜代叶绿素。D、皂化反应：取叶绿体色素提取液2mL于大试管中，加入4mL乙醚，摇匀，再沿试管壁慢慢加人3mL蒸馏水，轻轻混匀，静置片刻，溶液即分为两层，色素已全部转入上层乙醚中。用滴管吸取上层绿色层溶液，放入另一试管中，再用蒸馏水冲洗1-2次。在色素-乙醚溶液中加入足量30％KOH－甲醇溶液，充分摇匀，再加入蒸馏水约3-5mL，摇匀静置

8、。可以看到溶液逐渐分为两层上层是黄色素，下层是绿色素。五、数据记录1、菠菜叶片质量：2.0078g；玉米叶片质量：0.2016g2、吸光值测定：波长/nm吸收光谱菠菜玉米叶绿素a叶绿素b叶黄素胡萝卜素4000.2940.1690.0410.0960.1564100.3620.2140.0570.1050.164200.40.2180.0690.1170.1654300.4780.2620.0970.