《细胞生理》PPT课件

《《细胞生理》PPT课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第三章细胞生物学研究方法细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术用于细胞生物学研究的模式生物第一节细胞形态结构的观察方法光学显微镜技术（Lightmicroscopy）电子显微镜技术(Electromicroscopy)扫描遂道显微镜(Scanningtunnelmicroscope，STM)一、Lightmicroscopy普通复式光学显微镜技术荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）暗视野显微镜技术激光共焦扫描显微镜技术（LaserCo

2、nfocalMicroscopy）紫外线显微镜技术相差显微镜（phase-contrastmicroscope）微分干涉显微镜（differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC）录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）（一）普通复式光学显微镜技术普通光学显微镜1.构成：①照明系统;②光学放大系统;③机械装置2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。石蜡切片的基本流程材料固定(F.A.A固定液)→逐级脱水(不同浓度的酒精)→二甲苯透

3、明→透蜡→纯蜡包埋→材料修块→切片→二甲苯脱蜡→染色→逐级脱水(不同浓度的酒精)→封片→永久切片光镜样本制作影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率,分辨率是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,分辨率的大小决定于光波的波长和镜口率,通常是用相邻两点间的距离来表示.光学显微镜的分辨率(D=0.61λ/N．A．)其中λ为入射光线波长；可见光波长400~700nm,计算时取其平均值为550nm.N．A．为镜口率＝ｎsinα/2，n=物镜与标本间介质折射率；α=镜口角（聚光器交点对物镜镜口的张角）,镜口角总是

4、要小于180o,所以sinα/2的最大值必然小于1.几种介质的折射率介质折射率越接近镜头玻璃的（1.7）越好。油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5，如用α溴萘,镜口率可达1.6，根据计算,显微镜最小数值不会小于0.2μm,即分辨率约为0.2μm(人眼的分辨力为0.2mm)，因此显微镜的最大有效倍数为1000~1500。0.2μm这一数值是光学显微镜分辨率的极限.限制显微镜分辨率的关键因素是光的波长(光的衍射效应),光学显微镜无论制作得如何精密,都无法突破是一极限.紫外显微镜原理:光源光波越短,显微镜的分辨本领越

5、大.波长介于400nm与X射线之间的辐射称为紫外线或紫外光.特点:紫外线为光源,分辨率可提高一倍,用特殊材料(如石英等)制成的光学玻璃来制作显微镜透镜.常配有照相装置.用途:观察胶体颗粒,测定细胞核中有核酸含量.不足:价格比较昂贵,使用受限.（二）荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）荧光显微镜Fluorescencemicroscope荧光显微镜成像原理荧光显微镜成像原理荧光显微镜特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片(激发光滤片和阻断滤片)；照明方式通常为落射式。激发光滤片:光源和样品之

6、间,只让能激发荧光染料发光的特定波长的光通过.阻断滤片:物镜和目镜之间,只让染料所发出的荧光通过.荧光显微镜可以观察细胞内天然物质(自发荧光)或经短波光照射后发出荧光的物质(诱发荧光)，如叶绿体中的叶绿素能发出血红色荧光。也可观察诱发荧光物质，如用丫啶橙染色后，细胞中RNA发红色荧光，DNA发出绿色荧光，根据发光部位，可以定位研究某些物质在细胞内的变化情况。应用：直接荧光标记技术间接免疫荧光标记技术在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用。直接荧光标记技术用于观察能激发出

7、荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。Fluorescenceimage,DNAinblueandMicrotubulesingreen暗视野显微镜使照明光线不直接进入物镜。只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至的质点,分辨率比普通显微镜高了40倍,有些细胞器,如核、线粒体,均清晰可见。（三）激光扫描共焦显微镜技术（LSCM）（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理：激光共聚焦扫描显微镜光路图特点：在某一瞬

8、间只用很小一束光照明,这一束光通过检测器前的一个小孔后只让来自该焦平面的光成像.物镜和聚光镜同时聚焦到同一点.即它们互相共焦点.用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨率是普通光学显微镜的3倍,是荧光显微镜的1.4-1.7倍。像异常清晰.用途类似荧光显微镜，样品一般须经免疫荧光标记,但能扫描不同层次，形成立体图像。应用：由于它能